Орална интубација на возрасна зебрафил, модел за евалуација на цревниот внес на биоактивни соединенија

Резиме

Протоколот ја опишува возрасната риба од зебра сондирање со биолошка; потоа се дисецира и се подготвува цитометрија, конфокална микроскопија и qPCR црево. Овој метод овозможува управување со биоактивни супстанции за да се следи навлегувањето на цревата и евоцираниот локален имунолошки стимул. Релевантно е за испитување на цревната динамика на орална профилакса.

Апстракт

Вовед

Во биомедицински контекст, развиен е модел за тестирање на биолошките ефекти на соединенијата по орална интубација од интерес. Многу од анатомските и физиолошките карактеристики на цревата се зачувани помеѓу билатералните линии со цицачи и коскени риби 11. Овој орален модел на интубација поврзан со низводно анализирање може да биде алатка за да се обезбеди увид во биологијата на човекот, како и тест поле за биологија или други супстанции in vivo.

Протоколот за орална интубација може да го спроведе еден оператор, на пр. Успешно администрирање до 50 μL суспензија на протеински наночестички со тежина од 1 g, со висока стапка на преживување на риболов. Процесот е лесен за поставување и брз; 30 риби можат да се интубираат за 1 час. Протоколот за подготовка на цревата е клучен за обезбедување на клеточни примероци и за последователна анализа. Низводни примери на резултати што ја демонстрираат употребата на протоколот при добивање податоци во врска со цревната навлегување и квалитетна РНК за изолирање на qPCR. Протоколот ќе биде од голема корист за оние кои имаат соодветен модел за тестирање на динамиката на орална профилакса или други соединенија во цревата.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Сите експериментални процедури зебра-риба (Данио Рерио) се овластени од етичкиот комитет на Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH број 1582) во согласност со меѓународните водечки принципи за истражување на животни (ЕУ 2010/63). Сите експерименти со жива риба биле извршени на 26-28 ° C.

1. Подгответе опрема за орална интубација

Ставете околу 1 см фино силиконска цевка на игла за заклучување 31 G Luer за да го покриете врвот на иглата.
Исечете врвот на пипетата од стерилен филтер од 10 µL (приближно 2 см), земете го пофиниот крај и ставете го преку силиконската цевка како навлака. Осигурете се дека врвот на иглата излегува од пипетата за да не го повредите животното.
Иглата ставете ја на шприцот Luer Lock 100 μL.
ЗАБЕЛЕШКА: Исплакнете со етанол, а потоа со солен раствор на фосфат (PBS, видете материјали) темелно помеѓу третманите.

(2) потребните решенија

Подгответе раствор од 150 mg/L (за анестезија) или 300 mg/L (за евтаназија) етил 3-аминобензоат метанесулфонат (MS-222) со вода од аквариумот каде што се чува рибата зебра. Наполнете мал сад со 1 L раствор за анестезија и држете го проветрен.
Наполнете друг мал контејнер со 1 L вода аквариум без обновување риба MS-222 и држете го газиран.
Направете 50 ml 1x PBS од 10x стерилен раствор на залихи.
Анализа на цитометрија/изолирана цревна клетка Подгответе доволно свеж 0,15% раствор на колагеназа тип IV за 1 ml на риба од залихи раствор или прашок во Дулбеко модифициран орел медиум (ДМЕМ) со 1% V/V пеницилин и стрептомицин (видете материјал). Направете парчиња (1 по риба) од 1 mL во 2 mL цевки за центрифугирање. Одржувајте темпо на 4 ° C до 30 минути пред дисекцијата.
За да ја поправите конфокалната микроскопија/примерок, подгответе 50 ml свеж 4% раствор на параформалдехид (PFA) со пуфер PBS или одмрзнете залихи раствор во замрзнувач од -20 ° C во аспиратор.
Предупредување: PFA е токсичен. Прочитајте го листот за податоци за безбедност пред да работите со него. Треба да се носат ракавици и безбедносни очила, и секогаш оставајте раствори во хауба.

3. Производство на флуоресцентна суспензија на наночестички

4. Анестетизација на зебрафис и орална интубација

5. Дисекција на цревата од зебрафис

7. Подгответе цревни криосекции за конфокална микроскопија

8. Подготовка на цревата за qPCR во реално време (RT-qPCR)

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Мешана секс зебра риба (средна тежина: 1,03 ± 0,16 g) беше успешно интубирана со разни рекомбинантни наночестички протеини (тела за вклучување на бактерии) користејќи го нашиот домашен уред за орална интубација (Слика 1) Успешно извршивме орална интубација и постигнавме низок просечен процент на смртност (6,8%) (Табела 1) Зебрашиш биле интубирани или со 30 μL или 50 μL на суспензии на наночестички и била пресметана смртноста во рок од 24 часа по интубацијата. Експериментите беа извршени од двајца оператори, Р имаше помалку искуство во управувањето со оралната интубација на зебра риба од Ј. Резултатите покажаа дека дури и нов оператор може самостојно да изврши експерименти со орална интубација и лесно да постигне висока стапка на преживување преку овој протокол. Според нашето искуство, оптималната големина на риба е 1 g, но ние успешно интубиравме риба од 0,5 g.

Со цел подобро да се разбере дали флуоресцентната наночестичка IBs TNF eine (рекомбинантен цитокински протеин наноструктуриран како инклузивни тела) зебрафисот се пренесува според нашиот метод и се апсорбира во цревната риба или не, ние извршивме анализа на цитометрија. Наночестичките (100 μg/риба, 50 μL) и PBS (контрола) беа администрирани орално во зебра риба (со интубација) и цревата беше расчленета на 5 часа и 24 часа по интубацијата. Вкупните цревни клетки беа подготвени од чекор 6 и беа анализирани со откривање на сигналот за емисија на флуоресценција. Претставните хистограми на интензитетот на флуоресценцијата и точките на графиконите на процентот на флуоресцентни клетки се прикажани на слика 2прикажано. Густината на флуоресцентни клетки е значително поголема во групата со интубирани наночестички во споредба со контролната група за 5 часа и 24 часа (слика 2)А.) Процентите на флуоресцентни клетки се значително повисоки за 5 часа (46,3%) и 24 часа (43,0%) од наночестичките интубирани групи (Слика 2Б.).

За понатамошно проучување кој дел од цревниот слој е вклучен во навлегувањето на наночестички, извршивме анализа на конфокална микроскопија. Наночестичките (20 μg/риба, 50 μL) и PBS (контролна) беа орално интубирани на зебра риба и цревата беше расчленета на 5 часа по интубацијата. Делата на цревата беа замрзнати процедури за ткиво по чекор 7(Слика 3)подготвени Конфокалните слики на флуоресцентни наночестички во цревата се прикажани на слика 3Б.прикажано. Флуоресцентни наночестички беа пронајдени во цревата од зебра. Ја забележавме флуоресценцијата во епителните клетки, ламина проприа и мускулните клетки.

За да провериме дали можеме да извлечеме висококвалитетна РНК преку нашиот протокол, ја анализиравме РНК извлечена од цревата користејќи биоанализатор (овде се нарекува и РНК анализатор). Зебрашиш беа орално интубирани со PBS (50 μL) или наночестички (20 μg/риба, 50 μL). Цревата беа дисецирани за екстракција на РНК на 24 часа по интубацијата. Имаме седум примероци на РНК за тестирање со анализаторот. Откривме дека сите тестирани примероци на РНК имаат висок број на интегритет на РНК од 7,9 до 8,9 (Слика 4)).

илустрација 1 : Усна интубација. (А.) Слика на игла од 31 G Luer Lock на шприц од 100 μL со силиконска цевка и крај на врвот на пипетата фиксирани над врвот на иглата. (Б.) зголемена слика на делот од иглата. Црната стрелка покажува дека врвот на пипетата го надминува крајот на врвот на иглата. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 4 : Слика на виртуелниот гел на анализаторот на РНК покажува РНК извлечена од 7 црева од зебрафили, земени од примерок по интубација. Примерокот број 1 и 2 се групи на PBS интубирани и примерокот броеви 3 до 7 се наночестички интубирани групи. Броевите на интегритет на РНК (RIN) се дадени на дното од 7,9 до 8,9. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

оператор	волумен	# Интубирани риби	Средна тежина (g ± SD)	# Починати	Смртност (%)
Р.	30 ΜL	22-ри	0,88 ± 0,14	3	13.6
Р.	30 ΜL	17-ти	0,93 ± 0,19	0	0
Ј	50 ΜL	19-ти	1,23 ± 0,31	1	5.2
Ј	50 ΜL	30-ти	1,08 ± 0,40	2	6.6
Се на се	88	1,03 ± 0,16	6-ти	6.8
СД: стандардна девијација на средната вредност

Табела 1: Споредба на смртност од зебра-риба предизвикана од два оператори кои го користат протоколот. Се прикажуваат кодот за идентификација на операторот, интубираниот волумен, бројот на риби и тежината на рибите во грамови (g).

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Овој протокол е подобрување на претходно опишаната техника за орална интубација од страна на Колимор и сор. 4 од нашиот протокол детално го опишува методот на орална интубација и вклучува подготовка на цревата за последователна анализа. Нашиот метод ја подобрува брзината на манипулација со рибите, така што едно лице може да го изврши целиот протокол брзо и без многу варијации помеѓу операторите. Голема разлика од нашиот протокол со претходниот е тоа што го проценуваме успехот на оралниот експеримент со интубација не само со набудување на животното за благосостојба (на пр., Без крварење) и без истекување на администрираната течност, туку и со проверка на внесувањето на биоактивни наночестички во цревата со последователна анализа (цитометрија, конфокална микроскопија и qPCR). Покажуваме дека во цревата се пронајдени интубирани пенетранти означени наночестички.

Ограничувањата на нашата студија се големината на рибите, бидејќи не тестиравме администрација на риби помали од 0,5 g и употреба на хемиски анестетик за смирување на животните. Некои автори користат ладна вода (0-4 ° C) за анестезија на зебра, но од аспект на благосостојба на животните и европска правна перспектива, решивме дека MS-222 ќе биде метод на избор.

Зебрафисот нуди многу предности во однос на другите системи на модели, вклучувајќи комплетен сет на генетски податоци и достапните трансгени линии. За имунолозите, трансгеничните линии (на пр. SF Mpx: GFP и Tg Mpeg1: GFP) обезбедуваат сцена за ин виво набудување на имуните клетки како што се макрофагите и неутрофилите 19, 20. Комбинирање на нашата орална интубација и низводно анализирање со трансгени лози ќе биде идеално за идентификување на видовите клетки вклучени во навлегувањето, транспортот и обработката на орални вакцини, наночестички и патогени микроорганизми кај рибите.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Откривање

Авторите изјавуваат дека нема судир на интереси.

Признанија

Оваа работа беше поддржана од грантови од шпанското Министерство за наука, Европската комисија и фондовите AGAUR на НР (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER и 2014SGR-345 AGAUR). РТ има докторант од АГАУР (Шпанија), Jеј еј беше поддржан од грант за докторски студии од Кинаскиот совет за стипендии (Кина) и НР се базира на програмата Рамон и Кахал (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Му благодариме на д-р. Торелеба за компетентен совет во производството на протеини, Н. Барба од „Сервеи де Микроскопија“ и Др. M. Costa од „Servei de Citometria“ на Universitat Autònoma de Barcelona за корисна техничка поддршка.