Патот за полнење на портата на калиумовиот канал поврзан со епилепсија прифаќа хемиски лиганди

предмети
апстрактен
вовед
Резултати
Суштински улоги на конзервиран фенилаланин (F137) во активност на ztz240
Идентификација на повеќе критични остатоци во KCNQ2-VSD
Структурен модел на врзување на ztz240 со KCNQ2-VSD
Откривање нови активатори за врзувачкиот џеб ztz240
Анти-епилепсија активност на активаторите кои се насочени кон патот за полнење на портата
дискусија
Понатамошна информација
PDF-датотеки
Дополнителни информации, Слика С1
Дополнителни информации, Слика S2
Дополнителни информации, Слика S3
Дополнителни информации, Слика S4
Дополнителни информации, Слика S5
Дополнителни информации, Слика S6
Дополнителни информации, табела С1
Дополнителни информации, табела S2
Видеа
Дополнителни информации, филм С1

Видео: Преглед и инсталација на Jeep Wrangler Hitch Mounted Cargo Rack XL (1987-2016 YJ, TJ & JK) (ноември 2020 година).

предмети

апстрактен

вовед

Резултати

Суштински улоги на конзервиран фенилаланин (F137) во активност на ztz240

Идентификација на повеќе критични остатоци во KCNQ2-VSD

F137 е во средината на S2 сегментот на KCNQ2 VSD. Дизајниравме повеќе мутанти за остатоците што се наоѓаат на VSD. Меѓу функционалните мутации, E130A, I134A, G138A, R207W и R210A драматично ја намалија потенцирачката активност на ztz240 во сите три главни аспекти. Тие го намалија зголемувањето на односот на тековната амплитуда кон надворешната страна (I/I 0) и го спречија или ослабуваа левото поместување на кривата GV (ΔV 1/2) и забавувањето на деактивирањето (слика 2). Речиси преклопуваните опашки на струјата на овие мутанти со и без ztz240 јасно ги покажуваат намалените ефекти врз деактивирањето (дополнителни информации, табела S1). Спротивно на тоа, мутациите S105A и M174A ја намалија левата смена на кривата GV, но не го намалија односот I/I 0 и не спречија забавување на деактивирањето (слика 2 и дополнителни информации, табела S1). Идентификувањето на неколку основни остатоци дополнително ја покажува важноста на VSD за активноста на ztz240.

Идентификација на повеќе критични остатоци во KCNQ2-VSD за активност на ztz240. (А) Претставнички траги на идентификувани критични мутанти со и без 10 μM ztz240. (Б) Ефекти од 10 μM ztz240 врз амплитудата на надворешната струја на VSD мутантите (n> 3). Секое место на мутација е означено врз основа на предвидените трансмембрански региони. Пресечената линија покажува ниво на потенцијација од 10 μM ztz240 на каналот KCNQ2 од див тип. Потенцијалот за тестирање е +50 mV. (C) Ефекти од 10 μM ztz240 врз V 1/2 од VSD мутантите (n> 3). Δ V 1/2 ја означува промената на V 1/2 по примената на ztz240. ΔV1/2 = V1/2 во присуство на ztz240 - V1/2 во контролата.

Структурен модел на врзување на ztz240 со KCNQ2-VSD

Бидејќи не се утврдени експерименталните структури на KCNQ2 и неговите комплекси со други лиганди, тешко е да се изгради структурен модел за интеракција ztz240-KCNQ2. Соодветно на тоа, беше искористена хиерархиска стратегија за конструирање на структурниот модел преку широка употреба на моделирање на хомологија, молекуларно прицврстување и симулација на МД заедно со мутагенеза и електрофизиолошки определби. Резултатот од мутагенезата сугерира дека потенцијалниот џеб за врзување на ztz240 се наоѓа во VSD отколку во други домени (Слика 1). Понатамошните електрофизиолошки експерименти покажуваат дека ztz240 се врзува за VSD во отворена состојба (дополнителни информации, слика S3). Затоа, прво создадовме тродимензионален (3Д) модел за трансмембранскиот домен на KCNQ2 заснован на структурните информации на отворениот канал 29, 30, 31 на Kv1.2 со Discovery Studio 2.6 (дополнителни информации, слика S1B).

Моделот на врски ztz240 со VSD. (А., Б) Генерал (А) и детално (Б) Прегледи на интеракциите помеѓу ztz240 и VSD. ztz240 и остатоците се прикажани како топчести и стапови. Јаглерод, кислород, азот, хлор, флуор и водородни атоми во ztz240 се обоени светло сина, црвена, темно сина, зелена, портокалова и бела, соодветно. Само неколку клучни атоми на водород се прикажани за јасност. Водородните врски или електростатските интеракции се означени со црвени линии. Интеракцијата CH-π и халогената врска се означени со црни и зелени линии, соодветно. (C) Структурата на врзувачкиот џеб извлечена од структурните модели на комплекси на лиганд-VSD. Лигандите се отстранети заради јасност. Површината на торбата е прикажана во жолто. На десната страна се прикажани три пресеци на торбата однадвор. Остатоците се прикажани како стапчиња. „Надвор“ и „Внатре“ ги означуваат надворешните и внатрешните страни на клеточната мембрана.

Повеќето од критичните остатоци што го поставуваат врзувачкиот џеб се во S2 и S4, како што се E130, I134, F137, G138, R207 и R210, додека многу малку остатоци во S1 и S3 влијаат на врската, како што се S105 и M174 (Слика 3)) кои не се зачувани во изоформите на KCNQ. За понатамошна проценка на улогата на остатоците во надворешните сегменти на S1 и S3 при активирање на ztz240, преостанатите остатоци, со исклучок на оние наведени во 2B и 2C, беа испитани со скенирање на аланин и никој од нив не влијаеше значително на активноста на ztz240 ( Дополнителни информации, табела S1)). Овие дополнителни мутации и електрофизиолошки определувања ретроспективно го потврдуваат нашиот модел на врзување ztz240-KCNQ2 повторно.

Моделот на интеракција ztz240-KCNQ2 јасно опишува широк џеб во VSD кој се протега од вонцелуларната уста на VSD до R210 (Слика 3C). Овој можен џеб за врзување ztz240 во KCNQ2 делумно се преклопува со соодветните региони на патеките за полнење на портата на химеричните канали Shaker и Kv1.2-2.1, иако е пошироко и подлабоко (1А и 3C) 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 14, 15. Ова откритие е во согласност со претходните студии кои сугерираат дека VSD-каналите на Kv може да бидат места со дрога 19, 20. Нашата студија исто така откри дека патеката за полнење на портата на KCNQ2 може да има нова функционалност што делува како директен обврзувачки џеб за постојните и новоразвиените активатори како што се ztz240 и нови соединенија откриени во оваа студија (види подолу).

Откривање нови активатори за врзувачкиот џеб ztz240

Виртуелниот скрининг базиран на структура ги идентификува активаторите со различни хемотипови. (А) Зголемувањето на амплитудата на надворешната струја во присуство на соединението, како што е наведено. Потенцијалот за тестирање е -10 mV. Исцртаната линија покажува ниво на експоненцијација од 1 (т.е. нема експоненцијација). (Б) Криви на одговор на дозата YG002, YG025 и YG027 (n> 3 за секоја податочна точка). (C) Хемиски структури на откриените активатори. Фрагментите кои се ориентирани кон интрацелуларниот крај на VSD се означени со портокалова боја. (Г) Општ поглед на надредените обврзувачки модели на девет идентификувани активатори со VSD.

Анти-епилепсија активност на активаторите кои се насочени кон патот за полнење на портата

Извршена е примарна анализа за скрининг против епилепсија за да се процени активноста на овие соединенија кај глувците користејќи го моделот на напад предизвикан од максимален електрошок (МЕД). Меѓу тестираните активатори, ztz240, YG007 и YG018 покажаа стапка на заштита од> 50% и затоа беа избрани за понатамошна истрага во МЕД-индуцираните и пентилентетразол (PTZ) модели предизвикани од напади (дополнителни информации, табела S2). Ретигабин беше прекинат како позитивна контрола. Сите три соединенија покажаа одлична активност против епилепсија кај двата модели. Во моделот на напади предизвикани од МЕД, администрација на единечна доза на трите соединенија значително спречи издолжување на тоничните задни нозе. Стапките на заштита (100%, 90% и 90%) се споредливи со оние на ретигабин (Табела 1). Во моделот на напади предизвикани од PTZ, трите соединенија покажале активност против епилепсија, споредлива со онаа на ретигабин. Единечна доза на овие соединенија не само што значително ја одложи латентноста на клонот, туку исто така ја намали инциденцата на генерализиран тонично-клоничен напад (ГТЦС) и морталитетот (Табела 2).

дискусија

Патеката за полнење на портата на каналот KCNQ2 прифаќа хемиски лиганди. (А) Детали за тоа како активаторите комуницираат и влијаат на R207 и R210 кога се отворени, користејќи го примерот на ztz240 и YG002. Активаторите го пополнуваат просторот помеѓу R207 и R210. Исцрпуваните линии ги означуваат интеракциите помеѓу активаторите и R210. (Б) Цртежот покажува како хемиски лиганд делува на патот на полнење на портата со тоа што е во патот на полнежот на портата и спречува аргининот да се движи во надолна состојба.