Развој на паралелна мултикомпонентна анализа на реакции на антиген-антитела во

Развој на паралелна мултикомпонентна анализа на реакциите на антиген-антитела при анализа на допинг Дисертација за добивање на академски степен „доктор рерум натуралиум“ (д-р рер. Нат.) Во научната дисциплина на биохемијата поднесена од Каи Вундерлих Потсдам до Математичкиот и природно-научниот факултет на Универзитетот во Потсдам, 29.09.2014 г.

мултикомпонентна

Ова дело е лиценцирано според договор за лиценца на Криејтив комонс: Наведи извор Без комерцијална употреба Без деривативно дело 4.0 Меѓународно За да ги видите условите на лиценцата, следете ја хиперврската: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Online објавено на серверот за публикации на Универзитетот во Потсдам: УРН урна: nbn: de: kobv: 517-opus4-76869 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76869

Lifeивотот е како велосипед. Треба да одите напред за да не изгубите рамнотежа. Алберт Ајнштајн

Содржина Список на табели Список на слики V VII 1. Мотивација 1 1.1. Допинг во социјален и спортски контекст. 1 1.2. Забрани за допинг и потреба за допинг контроли 5 1.3. Можности и перспективи за тестови за нега во допинг контролите. 7 2. Основи 9 2.1. Терминот допинг и класификација на класи на супстанции во забранетата листа на ВАДА. 9 2.2. Аналитички методи за откривање на допинг-супстанции. 12 2.2.1. Гасна хроматографија/масена спектометрија како утврден аналитички метод за допинг анализа. 13 2.2.2. Методи за откривање засновано на имуноанализа за откривање на пептидни хормони и фактори на раст 15 2.2.3. Како работат антителата и нивната улога во имуноанализа. 16 2.3. Пептидни хормони како кандидати за развој на мултипараметарски тест за допинг. 19 2.3.1. Лутеинизирачки хормон (LH) и неговата улога како допинг агент. 20 2.3.2. Човечки хорионски гонадотропин (hcg-i) и неговата улога како допинг агент. 23 2.3.3. Варијанти на овие пептидни хормони и фармаколошки гранични вредности. 24 2.4. Технички концепт. 25 јас

4.3. Експерименти со микро-низа за да се утврди вкрстената реакција . 60 4.3.1. Експерименти со микро-низа со истовремена употреба на различни антитела за откривање на референтен материјал. 63 4.4. Одредете ја границата на квантификација на пептидните хормони на микроренијата. 67 4.4.1. Концентрациска серија на hcg-непроменети во 1 x PBS пуфер 67 4.4.2. Концентрациона серија на hcg-β во 1 x PBS пуфер. 68 4.4.3. Концентрациона серија на LH во 1 x PBS пуфер. 69 4.5. Мерење на вистински примероци на стакло и полимерни слајдови 70 4.6. Изведете анализа на перформансите за да ги одредите D-SN и D-SP. 72 4.6.1. Одредување на дијагностичката чувствителност и специфичност на LH, hcg-intact и hcg-β. 72 4.7. Тест за стабилност на складирање на микрорејчињата во однос на резултатите од мерењето. 77 4.7.1. Тест за стабилност на складирање во текот на дванаесет недели за откривање на hcg-непроменет. 77 4.7.2. Тест за стабилност на складирање во текот на дванаесет недели за откривање на hcg-β. 79 4.7.3. Тест за стабилност на складирање во текот на дванаесет недели за откривање на LH. 80 5. Дискусија 83 6. Изгледи 93 7. Резиме 95 Библиографија 99 A. Додаток 111 А.1. Бафери и решенија. 111 А.1.1. Состав на гел за сдс за одвојување и собирање на гел 113 А.2. Табели 114 А.3. Публикации. 126 A.3.1. Публикации со рецензии. 126

А.3.2. Предавања, како и постери и публикации без рецензии. 127 A.4. Продолжи 128 А.5. Денот на благодарноста. 129 А.6. Законска декларација. 130

Список на табели 3.1.1 Користени уреди. 29 3.1.2 Користени потрошни материјали. 30 3.1.3 Користени хемикалии и раствори. 31 3.1.4 Антитела. 32 3.1.5.Пептидни хормони и материјал за примерок. 33 3.1.6 Користен софтвер. 34 3.2.1. Оптоварување со гел SDS-PAGE. 36 3.2.2 Поставување на тест за Western blot. 37 3.2.3 Експериментална шема, вкрстена реакција на микро-низа. 42 3.2.4 Класифицирање на резултатите од мерењето со употреба на матрица на вистината 48 3.2.5 Големина на примерок за да се одреди репродуктивноста во текот на дванаесет недели. Тест на крос-реактивност на антитела на моноклонално снимање 56 4.1.2. Тест на крос-реактивност на антитела за откривање на поликлонални. 57 4.2.1. Споредба на растворите за перење на обработените микрорешири. 60 4.3.1 Тест за вкрстена реактивност со hcg-i на микро-зраци на откривање и секундарни антитела во 1 x PBS. 61 4.3.2 Определување на ефектите на матрицата и вкрстените реактивности кај сложените примероци. 4.5 4.5.1. Мерење на вистински примероци на стакло и полимерни слајдови 75 4.6.3 Евалуација на примерокот колектив од Институтот за биохемија во Келн. 76 4.7.1. Тест за стабилност на складирање на микро-низите за hcg-i во текот на дванаесет недели. 78 с

4.7.2 Тест за стабилност на складирање на микро-низите за hcg-β во текот на дванаесет недели. 80 4.7.3 Тест за стабилност на микро-низите за LH во текот на дванаесет недели 81 А1. Примерен клуч за 130 примероци од серум за анализа на перформансите. 114 А2. Крос-реактивен тест на микро-зраци на откривање и секундарни антитела во различни концентрации на hcg-i во 1 x PBS. 118 А3. Тест за вкрстена реакција на микро-зраци на детекција и секундарни антитела во различни концентрации на hcg-i во референтен материјал. 119 А4. Тест за вкрстена реакција на микро-зраци на откривање и секундарни антитела во референтен материјал. 120 А5. Одредување на матричните ефекти и вкрстените реактивности кај сложените примероци. 121 А6. Евалуација на колективниот примерок од Институтот за биохемија во Келн. 122 А7. Тест за стабилност на микро-низите за hcg-i во текот на дванаесет недели123 A8. Тест за стабилност на микро-низите за hcg-β во текот на дванаесет недели. 124 А9. Тест за стабилност на микро-низите за LH во текот на дванаесет недели 125

Список на слики 2.1. Список на забранети супстанции 2013 од страна на WADA. 11 2.2. Анализа на примероци за допинг. 13 2.3. Дијаграм на проток на работа. 27 3.1. Шема на самото место на микро-низите. 40 4.1. SDS-PAGE за да се провери концентрацијата на протеини. 54 4.2. Резиме на тестот за вкрстена реакција на микро-низата на стакло-слајдовите модифицирани со GLYMO. 66 4.3. Концентрациска серија на хуман хорионски гонадотропин hcg во 1 x PBS. 67 4.4. Концентрациона серија на hcg-β во 1 x PBS пуфер. 68 4.5. Концентрациона серија на LH во 1 x PBS пуфер. 69 4.6. Концентрациона серија на LH во целосен серум. 70 VII

2.1. Терминот допинг и класификација на класи на супстанции во Забранетата листа на WADA Сл. 2.1.: Список на забранети супстанции на WADA 2013 (скратено). Класите на супстанции (и примери) наведени овде се забранети во секое време во и надвор од натпреварите. Пептидните хормони наведени во точка S 2.2 (црвена кутија): хорионски гонадотропин (CG) и лутеинизирачки хормон (LH) се забранети само кај мажите затоа што имаат регулирачки ефект врз каскадата на тестостерон. Двата хормони се одредуваат од урина со помош на имуноанализа. [WADA, 2012] 11

3. Материјална и експериментална работа и биоактивност од 14 000 U/mg. Ова одговара на биоактивност од 14,000 му/μl во растворот за суровини. Β-поддиницата на hcg е достапна како резервен раствор со концентрација од 0,1 mg/ml. Производителот не наведува никаква биоактивност за ова. Според [Stenman et al., 2006], биоактивноста за hcg-β е дадена како 1 U/μg. Соодветно на тоа, основниот раствор на hcg-β содржи 100 U/ml или 100 mu/μl. LH беше присутен во концентрација од 0,1 mg/ml. Таб. 3.2.3.: Тест шема за откривање на можна вкрстена реакција на компонентите на анализата. Како матрица примерок, стандардниот серум/крв и контролен серум/крв исто така беа тестирани според истата шема, аналогно на пуферот 1 x PBS. Крстите се залагаат за комбинации на пептидни хормони и антитела за откривање. антитела за откривање на поликлонали против пептидниот хормон hcg-α hcg-β LH CRP - - - - x - - - - - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 100 mu/ml LH - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 500 mu/ml hcg - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 36 mu/ml hcg-β - x - - - - x - - - - x 42