Регулирање на автоимуни болести преку полиморфизам на PTPN КТ и генот NCF1
Од Институтот за клиничко истражување на мозокот во Херти при Универзитетот во Тибинген Оддел за општа неврологија В.д. A. Melms регулирање на автоимуните болести од страна на PTPN22 1858 * C/T полиморфизам и NCF1 генска/псевдогена структура инаугуративна дисертација за добивање на докторска диплома по медицина на медицинскиот факултет на Универзитетот Еберхард Карлс од Тибинген претставена од Питер Хофман од Штутгарт Бад Каннстат 2010 г.
Декан: професор др. I. B. Autenrieth 1. Известувач: професор др. Д-р R. Weissert 2-ри известувач: професор др. Т. Гасер
Содржина 1 Список на кратенки 1 2 Вовед и прашање 3 2.1 Сложени генетски автоимуни заболувања 3 2.1.1 Дефиниција и епидемиологија 3 2.1.2 Етиологија и патогенеза 3 2.2 Не-рецептор на мијастенија и протеин тирозин фосфатаза 22 6 2.2.1 Мијастенија гравис 6 2.2.1.1 Дефиниција 6 2.2.1.2 Епидемиологија 6 2.2.1.3 Симптоми 6 2.2.1.4 Курс 7 2.2.1.5 Неонатална мијастенија гравис 8 2.2.1.6 Истовремени болести 8 2.2.1.7 Невромускулен пренос 8 2.2.1.8 Патогенеза 10 2.2.1.9 Значење на тимусот 11 2.2.1.10 клинички класификации и оценки 12 2.2.1.10.1 Класификација според Осерман и Генкинс 12 2.2.1.10.2 Мијастенија Гравис Резултат според Бесингер 13 2.2.1.11 Дијагностика 13 2.2.1.11.1 Фармаколошко тестирање 13 2.2.1.11.2 Повторувачка стимулација со употреба на електромиографија 13 2.2.1.11.3 Дијагностика на антитела 14 2.2.1.12 Терапија 15 2.2.1.12.1 Инхибитори на ацетилхолинестераза 15 2.2.1.12.2 Имуносупресивна терапија 16 2.2.1.12.3 Тимектомија 16 2.2.2 Не-рецептор на протеини тирозин фосфатаза 22 17 2.2.3 Истражувачко прашање 18 2.3 Мултиплекс склероза/маларија и неутрофилен цитозоличен фактор 1 19 I.
2.3.1 Мултиплекс склероза 19 2.3.1.1 Дефиниција 19 2.3.1.2 Епидемиологија 19 2.3.1.3 Слика на болеста 20 2.3.1.4 Формулари на курсот 20 2.3.1.5 Дијагностички критериуми 21 2.3.1.6 Прогноза 24 2.3.1.7 Патогенеза 25 2.3.1.8 Дијагностика 27 2.3.1.8. 1 дијагностика на ЦСФ 27 2.3.1.8.2 Електрофизиолошка дијагностика 28 2.3.1.8.3 Томографија со магнетна резонанца 28 2.3.1.8.4 Скали за проценка на попреченост 28 2.3.1.9 Терапија 28 2.3.2 Маларија 31 2.3.2.1 Дефиниција 31 2.3.2.2 Епидемиологија 31 2.3 .2.3 Развој на циклусот на паразитот 31 2.3.2.4 Симптоми 32 2.3.2.5 Терапија 33 2.3.3 Реактивни метаболити на кислород 33 2.3.4 Неутрофилен цитозоличен фактор 1 35 2.3.4.1 Дефиниција 35 2.3.4.2 NADPH оксидаза 35 2.3.4.3 CF1 ген и псевдогени 36 2.3.4.4 NCF1 и автоимуни болести 40 2.3.5 Истражувачко прашање 40 3 Материјал и методи 41 3.1 Мијастенија гравис и PTPN22 41 3.1.1 Пациенти 41 3.1.2 Материјал и опрема 41 3.1.2.1 SNP генотипирање 41 II
3.1.2.2 Анти-титин антитела Елиса 41 3.1.2.3 Анти-AChR радиоимуноанализа на антитела 42 3.1.3 Методи 42 3.1.3.1 SNP Генотипизација 42 3.1.3.1.1 SNP Генотипизација Микс 42 3.1.3.1.2 Такман Универзален господар микс 43 3.1.3.1.3 Полимеразна верижна реакција, принцип 43 3.1.3.1.4 Генотипизација, принцип 43 3.1.3.1.5 Полимеразна верижна реакција, имплементација 45 3.1.3.2 Анти-титин антитело ELISA 46 3.1.3.2.1 Ензимски поврзан имуносорбентен тест, принцип 46 3.1.3.2.2 Анти-титин антитела ELISA 46 3.1.3.3 Анти-AChR антитела радиоимуноанализа 48 3.1.3.4 Статистичка анализа 48 3.2 NCF1 и мултиплекс склероза/маларија 49 3.2.1 Население на пациенти 49 3.2.2 Материјал и опрема 50 3.2.2.1 Раздвојување на ДНК од целокупната човечка крв 50 3.2.2.2 Генотипови на NCF1 50 3.2.2.3 Електрофореза на гел од агароза 51 3.2.2.4 Разделување на клетките на моноцити и гранулоцити 51 3.2.2.5 Броење и разредување на полиморфонакулерни клетки и мононуклеарни клетки на периферната крв 52 3.2. 2.6 Означување на антитело со Р-фикоетрин 52 3.2.2.7 тест Брадфорд 53 3.2.2.8 Боење на моноцити и гранулоцити со Р-ПЕ-обележани п47-фокс (Д-10) антитела 53 3.2.3 Методи 53 3.2.3.1 Разделување на ДНК од човечка целосна крв 53 3.2. 3.2 NCF1 генотипизација 54 3.2.3.2.1 Taqman Universal Master Mix 54 3.2.3.2.2 Полимеразна верижна реакција 55 III
3.2.3.2.3 Генотипизација 55 3.2.3.3 Електрофореза на гел од агароза 56 3.2.3.4 Разделување на клетки на моноцити и гранулоцити 56 3.2.3.4.1 Одвојување на клетки 56 3.2.3.4.2 Разделување на моноцити и лимфоцити 57 3.2.3.4.3 Одвојување на Гранулоцити 57 3.2.3.5 Броење и разредување на PMN и PBMC 58 58 3.2.3.6 Етикетирање на антитело со R-фикоетрин 58 3.2.3.6.1 p47-фокс (Д-10): sc-17845 58 3.2.3.6.2 Обележување 58 3.2 3.3.7 тест Брадфорд 59 3.2.3.7.1 Принцип 59 3.2.3.7.2 Постапка 60 3.2.3.8 Боење на моноцити и гранулоцити со Р-ПЕ-обележани антитела p47-фокс (Д-10) 60 3.2.3.9 Цитометрија на проток/Сортирање на активирана клетка со флуоресценција 61 3.2.3.9.1 Принцип 61 3.2.3.9.2 Цитометрија на проток 61 3.2.3.10 Статистичка анализа 62 3.2.3.10.1 Маларија 62 3.2.3.10.2 Мултиплекс склероза 62 4 Резултати 63 4.1 Мијастенија гравис и PTPN22 63 4.1.1 Резултати од мерењата 63 4.1.2 Алелна фреквенција и дистрибуција на генотипови 63 4.1.3 Алелни фреквенции во подгрупите на пациенти со МС 64 64,2 NCF1 и повеќе Количини на склероза/маларија 4.2.1 GT/GTGT и количини MS 66 4.2.2 GT/GTGT се поврзани со подфенотипови на количници MS 66 4.2.3 GT/GTGT и маларија 69 4.2.4 Корелација на GT/GTGT Однос со производството на РОС кај пациенти со маларија 70 IV
4.2.5 количини на GT/GTGT и концентрација на хемоглобин 70 4.2.6 проточна цитометрија на моноцити, лимфоцити и гранулоцити 71 5 Дискусија 73 5.1 Мијастенија гравис и PTPN22 73 5.1.1 Вовед 73 5.1.2 Поврзување на полиморфизам PTPN22 со мијастенија гравис 73 5.1.3 Асоцијација на полиморфизам PTPN22 со појава на анти-AChR антитела и антитела против титин 73 5.1.4 Анти-титински антитела и тимоми 74 5.1.5 Генотипови во зависност од статусот на тимом 75 5.1.6 Анализа на подгрупа на пациенти со МГ без тимом 75 5.1.7 Споредба на нашите резултати со претходните студии 76 5.1.8 Резиме и изгледи 78 5.2 NCF1 и мултиплекс склероза/маларија 79 5.2.1 Вовед 79 5.2.2 количници GT/GTGT кај пациенти со мултиплекс склероза 79 5.2.3 GT/Коефициенти на GTGT кај пациенти со маларија и споредба со производство на ROS 80 5.2.4 Критика на методот 81 5.2.4.1 Генотипизација на фрагменти од NCF1 81 5.2.4.2 Цитометрија на проток на моноцити, лимфоцити и гранулоцити 82 5.2 .5 Резиме и перспектива 82 6 Резиме 83 6.1 Мијастенија Гравис и PTPN22 83 6.2 NCF1 и мултиплекс склероза 84 6.3 NCF1 и маларија 85 7 Библиографија 86 Признанија 104 Curriculum Vitae 105 V
Листа на кратенки 1 Листа на Кратенки ACH = Ацетилхолинот AChR = ацетилхолин рецептор АЕИ = автоимуни болести BSA = говедски серумски албумини CTLA4 = цитотоксични Т-лимфоцитен антиген 4 dns = деоксирибонуклеинската киселина EAE = експериментниот автоимун Encephalomy = Forster = експериментниот автоимун Encephalomy = Forster Статус Скалата = Напредно Encephalomy = Forster = Напредно Encephalomy = Forster = Напредно Encephalomy статус антиген на човечки леукоцити IVIg = интравенски имуноглобулини KI = интервал на доверба LYP = лимфоидна тирозин фосфатаза MG = мијастенија гравис МГБ = врзивно средство за врзување во жлеб MHC = главен комплекс за хистокомпатибилност MRT = томографија на магнетна резонанца = MS = мултиплекс склероза NADPH фактор на никосидан Коефициент на непарен p47-фокс = Протеин47 фагоцитен оксидаза PBMC = мононуклеарни клетки на периферната крв PBS = физиолошки солен раствор со фосфат-пуфер PCR = полимераза верижна реакција Фокс = фагоцитен вол идаза PMA = форбол-12-миристат-13-ацетат PMN = полиморфни нуклеарни клетки 1
Список на кратенки PTPN22 = протеин тирозин фосфатаза не-рецептор 22 РА = ревматоиден артритис РОС = реактивни метаболити на кислород (реактивни видови оксигени) R-PE = Р-фикоеритрин ССЦ = страничен расеј СЛЕ = системски лупус еритематозус СНП = единствен нуклеотиден полиморфизам 2
Прашање за вовед и истражување 2.2.1.8 Патогенеза Во МГ, густината на јонскиот канал AChR е намалена на мускулната крајна плоча [Пестронк и др., 1985] и крајната плоча е уништена. Синаптичкиот јаз помеѓу нервниот крај и постсинаптичката мускулна мембрана се зголемува [Енгел и сор., 1976]. AChR јонските канали поврзани со автоантитела се ендоцитизираат и се распаѓаат побрзо. Со посредство на дополнување, врзувањето на антителата доведува до уништување на постсинаптичкиот апарат со намалување на апаратот за постсинаптички прст (види слика 2). Антителата AChR директно го блокираат јонскиот канал AChR [Köhler et al., 2003]. Намалениот број на отворени јонски канали AChR резултира со помал потенцијал во мускулната крајна плоча, што повеќе не е доволно за да се создаде потенцијал за дејство. Помал број активирани мускулни влакна доведува до мускулна слабост опишана погоре. Дури и кај пациенти со чисто окуларни симптоми, постои намалување на АхР на крајните плочи на екстремитетите, што, сепак, останува субклинички. А: здрав невромускулен пренос Б: невромускулен пренос кај мијастенија гравис Сл. 2: невромускулен пренос [од Drachman, D. B., 1994] 10
Прашање за вовед и истражување 2.2.1.9. Важноста на тимусот Кај пациенти со МГ, тимусот често морфолошки се менува. Постои тимитис со лимфофоликуларна хиперплазија, атрофија на тимус или тимом. Една од причините за оваа асоцијација може да биде антигенска молекуларна мимикрија: сопствени или егзогени антигени кои се слични на епитопите на јонските канали на AChR активираат автореактивни Т-клетки. Компонентите на вирусите на херпес симплекс или бактериските инфекции, во кои се дискутира за индукција на МГ, може да се сметаат како егзогени антигени [Швимбек и сор., 1989]. Во малигниот тимом, постои зголемен израз на неврофиламенти, кои би можеле да функционираат како автоантигени детерминанти, бидејќи тие имаат епитоп сличен на AChR. Открива тимоми во 8,5-15% од случаите кај пациенти со МГ [Вилкинс и сор. 1999 година, Лоерер 1999 година, Ото 1998 година]. 11
Прашање за вовед и истражување 2.2.1.10 Клинички класификации и оценки 2.2.1.10.1 Класификација според Осерман и Генкинс Класификацијата според Осерман и Генкинс (види Табела 1) е утврдена за да се процени сериозноста на состојбата на МГ-болеста. Табела 1: Класификација на мијастенија гравис според Осерман и Генкинс (1971) Класична клиничка форма Симптоми I Окуларна форма Птоза, диплопија IIа Лесна генерализирана форма Лесна генерализирана слабост IIб Фациофарингеална форма IIа + слабост на булбарна III Тешка акутна генерализирана форма Акутна тешка генерализирана слабост, булбарни симптоми, респираторна инсуфициенција IV тешка хронична генерализирана форма тешка, често прогресивна генерализирана слабост 12
Започнување и прашање на МГ претежно се карактеризира со орофарингеална слабост и помалку симптоми на окото [Еволи и сор., 2003]. 2.2.1.12 Терапија Третманот на МГ се заснова на следниве столбови [Köhler et al., 2003]: - Администрација на инхибитори на ACh естераза, кои го подобруваат невромускулниот пренос - Имуносупресивна или имуномодулаторна терапија за намалување на антигенските антитела -Комплекс предизвикана воспалителна реакција - Интервентни терапевтски мерки за третман на акутно влошување како што е мијастенична криза, на пр. терапевтска размена на плазма со помош на плазмафереза или имуноасорпција [Shibuya et al., 1994] - тимектомија 2.2.1.12.1 Инхибитори на ацетилхолинестеразата Ахитистички инхибитори се врзуваат во близина на каталитичката единица на ACh естераза и се значително побавни во споредба со ACh хидролизиран. Карбамилната група ковалентно се пренесува на ACh естеразата и ја инхибира ензимската активност со часови. Снабдувањето со ACh во синаптичкиот јаз се зголемува и ACh има повеќе време да ги окупира местата на врзување на постсинаптичката мембрана. Најчеста активна состојка е пиридостигмин бромид (Местинон) во дози до 300 mg/d. 15-ти
Иницијацијата и испрашувањето се дијагностицираат доколку се забележи временска и просторна дисеминација на лезиите, на пр. се забележува со слики (види Табела 2). Со цел да се дијагностицира МС, слични клинички слики (на пр. Колагеноза, васкулитис, борелиоза или саркоид) мора да бидат исклучени. МС е кога критериумите се исполнети и нема подобро објаснување за клиничките симптоми. Можна MS е кога постои сомневање, но критериумите не се целосно исполнети. 22-ри
Прашање за вовед и истражување FAD = флавин аденин динуклеотид Fe = железо GDI = инхибитор на дисоцијација на гуанозин дифосфат БДП = гуанозин дифосфат GTP = гванозин трифосфат NADPH = никотинамид аденин динуклеотид фосфат мембрано-врзаните единици gp91-phox и p22-phox. Интеракцијата помеѓу единиците врзани за p47-фокс и мембраната е неопходна за активирање. Прво на сите, протеинот Rac мора да се оддели од Rho GDI протеинот и да влезе во состојба активирана од GTP. Тогаш ова може да дојде во асоцијација со плазматската мембрана. Плазматскиот комплекс бара неколку фосфорилации, така што тој може да се поврзе со мембрано-врзаните единици. Активираната NADPH оксидаза произведува супероксидни анјони кои се ослободуваат во фагоцитните везикули или во вонклеточниот простор [Heyworth et al., 2003]. Сл. 3: Активирање на NADPH оксидаза [од Heyworth et al. 2003] 37
Прашање за вовед и истражување Во човечкиот геном има два псевдогени (ψncf1) по ген NCF1. Тие се 98% идентични со генот NCF1 и се наоѓаат во истиот регион 7q11.23 на хромозомот 7 [Heyworth, Cross et al., 2003 година] Се прави разлика помеѓу типот I ogenenncf1, кој содржи бришење на GT на почетокот на егзонот 2, и тип II ψncf1, кој не содржи бришење GT [Heyworth, Noack et al., 2002]. Во популацијата обично има два различни хаплотипа, почестиот хаплотип со две копии од типот I ψncf1 и една копија на NCF1 и пореткиот хаплотип со по една копија од типот I и тип II ψncf1 и една копија од функционалниот ген [Heyworth et ал., 2002]. Честата појава на мутација на ГТ кај хронична грануломатоза може хипотетички да се објасни со настани на рекомбинација помеѓу NCF1 и тип I ψncf1 (види Слика 4). Поради нивната близина и нивниот висок степен на сличност, ваквите настани на рекомбинација може да се појавуваат почесто. Тип II ψncf1 веројатно произлегува од рекомбинација помеѓу NCF1 и тип I ψncf1. Сл. 4, модел на можен кросовер помеѓу NCF1 и Тип I ψncf1 [од Heyworth et al., 2003] 38