Студијата за репликативна стареење на кучешки кожни фибробласти како придонес за

Од Ветеринарниот анатомски институт на Ветеринарно-медицинскиот факултет на Универзитетот во Лајпциг Истражувањето на репликативната стареење на кучешки дермални фибробласти како придонес за истражување на стареењето Инаугуративна дисертација за добивање на диплома докторски медицински ветеринарии (д-р. Медицина.) Од страна на Ветеринарно-медицинскиот факултет на Универзитетот во Лајпциг поднесена од Сузана Стрит од Хале/Зале Лајпциг, 2006 година

студијата

Со одобрение на Ветеринарниот факултет на Универзитетот во Лајпциг деканот: проф. Карстен Фелхабер Супервизор: Проф. медицински ветеринар хабил Франц-Виктор Саломон Рецензент: 1. Проф. медицински ветеринар хабил Франц-Виктор Саломон Институт за ветеринарна анатомија, Факултет за ветеринарна медицина, Универзитет во Лајпциг 2. Др. рер. нат хабил Улф Андерег Оддел за експериментална дерматологија Универзитетска клиника за кожа Универзитет во Лајпциг Лајпциг 3. Проф. Д-р х.ц. Вилфрид Крафт I. Медицинска ветеринарна клиника, Оддел за ветеринарна медицина, Универзитет Лудвиг Максимилијанс, Ден на одбраната во Минхен: 19 декември 2005 година

Содржина 1 Вовед 1 2 Преглед на литература 3 2.1 Стареење 3 2.1.1 Дефиниции на поимот стареење 3 2.1.3 Просечен и максимален животен век 4 2.1.4 Стареење на различни видови 4 2.1.5 Очекуван животен век на видот на кучето (Canis familiaris) 6 2.1.6 Ефекти на стареење врз видовите кучиња 9 2.2 Истражување на стареење 11 2.2.1 Теории на стареење 11 2.2.2 Нивоа на стареење според ХЕЈФЛИК (1985) 12 2.2.2.1 Теории на органи 12 2.2.2.2 Физиолошки теории 12 2.2.2.3 Теории базирани на геноми 13 2.2.3 Клеточна стареење 14 2.2.4 Употреба на фибробласти за ин витро експерименти 17 2.2.5 Однесување на фибробластите ин витро и врска со максималниот и просечниот животен век на видот, возраста на донаторот и здравствената состојба на донаторот 17 2.2.6 Одредување на параметрите на репликативниот Стареење 20 2.2.7 Кучиња во истражување на стареење 21 2.2.8 Продолжување на животниот век 22 3 Animивотни, материјал, методи 24 3.1 Тест животни 24 3.2 Материја залог 25 25 3.2.1 Користени хемикалии 25 3.2.2 Бафери и раствори 26 3.3 Методи 27 3.3.1 Клеточна култура 27 3.3.1.1 Материјал на примерок 27 3.3.1.1.1 Собирање примерок 27 3.3.1.1.2 Подготовка на примерок 27

3.3.1.2 Одгледување клетки 28 3.3.1.2.1 Услови за одгледување 28 3.3.1.2.2 Промена на средина 28 3.3.1.2.3 Субкултивација 28 3.3.1.2.4 Броење на клетки и дамка со сино трипан 29 3.3.1.2.5 Замрзнување на клетките 29 3.3.1.2. 6 Одмрзнување на клетките 29 3.3.1.2.7 Креирање кривини на раст 30 3.3.2 Цитолошки и имуноцитохемиски прегледи 30 3.3.2.1 Боење на Азан според Хајденхаин 30 3.3.2.2 Боење на Гиемса 31 3.3.2.3 Откривање на микоплазма со помош на анализа на флуоресценција 31 3.3.2.4 Имунохистохемија 32 3.3. 3 Фотографска документација 33 3.3.3.1 Фотографирање на живи клетки 33 3.3.3.2 Фотографирање на дамки од клетки направени 34 3.3.3.3 Мерење на фотографирани клетки 34 3.3.3.4 Статистичка анализа и дијаграми 34 3.4 Пресметување на параметрите на клеточната култура 34 4 Резултати 36 4.1 Прелиминарни тестови 36 4.2 Морфологија на култивирани клетки 37 4.3 Анализа на флуоресценција 41 4.4 Имунохистохемија 42 4.5 Параметри на пролиферација на култивирани клетки 43 4.5.1 Вкупен број на клетки и виталност г култури на клетки 43 4.5.2 Поставување на размножување 46 4.5.3 Криви на раст 48 5 Дискусија 55 5.1 Критика на методологијата 55 5.1.1 Избор на тест животни 55 5.1.2 Изведување на експериментот 57 5.2 Значењето на системите за култура воопшто и особено 60

6 Резиме 72 7 Резиме 74 8 Библиографија 76

Список на употребени кратенки ABC комплекс BSA CPDL DAB DAPI DMEM DMSO DNA EDTA et al. FBS GSF HPDL IVL PBS PCR PDL PFA RNA TBS Tris Tris-HCl CNS Стрептавидин-биотин комплекс стрептавидин-биотин комплекс на кумулативно население двојно зголемено ниво 3,3'-диаминобензидин-тетрахидрохлорид 4 ', 6-диамидин-дилхидин-дилдилдин-дилдилдин-дилдилдин-дилхидинолдилдилдилдин "-диладиндилдин-дилхидин-дилдилдин-дилхидинолдилдилдилдилдидолдин": Изменето орел среден диметилсулфоксид деоксирибонуклеинска киселина, деоксирибонуклеинска киселина етилендиамин тетраоцетна киселина и други, и други фетални горумски серуми Центар за истражување на животна средина и здравје во Здружението Хелмхолц највисоко ниво на удвојување на населението ин витро животен век фосфат солен раствор на сол, фосфера бифе, раствор на фосфера, полифемера, полифемера-бисерин Верижна реакција Ниво на двојно зголемување на популацијата, параформалдехид рибонуклеинска киселина, солен раствор на рибонуклеинска киселина Трис, физиолошки раствор на Tris-(хидроксиметил) -аминометан Трис-хидрохлорид коза нормален серум

Проблематичното производство на фибробласти, ниските потреби за одгледување и високиот потенцијал на поделба на овие клетки претставуваат значителна предност во однос на другите типови на клетки (PEACOCKE et al. 1991, SMITH et al. 1984). Целта на оваа работа беше истражување на можните врски помеѓу возраста на животното и пролиферативното однесување на неговите клетки (кожни фибробласти) (во раса на кучиња Бигл). За таа цел, беа воспоставени примарни и секундарни клеточни култури на кучешки кожни фибробласти од различна возраст. Параметрите како што се нивото на удвојување на популацијата (PDL), кумулативното ниво на удвојување на населението (CPDL), највисокото ниво на удвојување на населението (HPDL), времето на генерирање и животниот век на ин витро (IVL) го опишуваат репликативниот потенцијал на култивираните клетки. Користејќи ги овие параметри, клеточните култури на млади, возрасни и стари животни беа споредени едни со други. Резултатите од оваа работа претставуваат можна основа за понатамошно истражување на клеточното стареење на кучиња со помош на ин витро модели.