ТЕЗА ЗА ДИПЛОМА. Биолошка активност на ново синтетизиран дериват на тиокарбонска киселина (MAH4 HCl) на изолирани органи од заморчиња
1 ДЕПЛОМА ТЕЗА Биолошка активност на новосинтетизиран дериват на тиокарбонска киселина (MAH4 HCl) на органи изолирани од заморчиња Автор Озлем Четинкаја Посакувана академска диплома Магистра дер Фармазие (Маг.фарм.) Виена, 2012 Број на студијата според листот на студијата: Супервизор од 449 според студискиот лист: Ао Унив.-Проф. Д-р Кристијан Студеник
2 За моето семејство и Бернхард
3 благодарници Прво на сите би сакал да им се заблагодарам на моите родители Фирдес и Мехмет Четинкаја, моите браќа и сестри Ејлем, Ејлен, Озден и Мурат, како и на мојот вереник Бернхард, кој застана зад мене за време на целото студирање. Со мојот претпоставен Ао. Унив.-Проф. Д-р Од дното на моето срце му благодарам на Кристијан Студеник за вредните импулси и за големата, човечка и компетентна поддршка. Би сакал да му се заблагодарам и на господинот Ао. Унив.-Проф. Д-р Томас Еркер и работната група на Одделот за медицинска/фармацевтска хемија за обезбедување на тест супстанцијата.Исто така, сакам да им изразам срдечна благодарност на моите пријатели Алма Сејдиновиќ, Милада Авдиќ и Хамди Канан за нивната активна поддршка. Со нив, учењето во библиотеката АКХ беше многу позабавно. Отсекогаш сте биле со мене во добри и лоши периоди и секогаш ќе имате одлично место во моето срце. Потоа би сакал да им се заблагодарам на моите сведоци, Мастал, за нивната голема поддршка во лектурата на тезата.
4 Содржини 1 Вовед Хипертензија на срцето Водород сулфид Цели Материјал и методологија Тест на супстанции MAH4 HCl растворувач експериментални животни Физиолошки електролитски раствор на органи Користени материјали за подготовка Користени десни преткомори Пулмонална артерија Папиларен мускул (Musculus papillaris) Мали црева (Илеум терминал аортинус) Карбоген Изведување на експерименти Ефект на супстанциите врз изолираните органи заморчиња Атриум декстер (десен атриум) Musculus papillaris (папиларен мускул) Терминален илеум (тенкото црево) Аорта опаѓачка пулмонална артерија (пулмонална артерија)
5 3.6.2 Истражувања на механизмот на дејство на MAH 4HCL во цревата Истражувања со глибенкламид и нитро-Л-аргинин Евалуација на податоците и статистиките Атриум декстер Мускул папиларис Аорта, Артерија пулмоналис, Терминалис илеум Резултати од статистиката Резултати од испитната супстанција илеум на терминалот на пулмоналната артерија се спушта Истражување на механизмот на дејство на испитната супстанција MAH4 HCl врз цревата Ефект на MAH4 HCl во комбинација со NO-L-аргинин врз цревата Ефект на MAH4 HCl во комбинација со глибенкламид на дебелото црево Резиме на дискусија Резиме на библиографија Наставна литература
15 3 Материјал и методологија 3.1 Тест супстанција Супстанцијата што треба да се тестира е тестирана на Факултетот за животни науки на Катедрата за медицинска/фармацевтска хемија од страна на Ао. Унив. Проф. Томас Еркер ново синтетизиран и ставен на располагање за испитување на MAH4 HCl Слика 1: Хемиска структура на MAH4 HCl MG: 297,89 g/mol октил [2- (диметиламино) етокси] метатиоат хидрохлорид 10
16 3.1.2 Растворувач За да се спроведат експериментите, супстанцијата треба претходно да се раствори во соодветен растворувач. MAH4 HCl беше многу брзо и целосно во далечната. Аква растворлив. Почетната тежина секогаш беше избрана така што да се постигне концентрација од 100 μmol/l во садот во органските бањи по целосното, кумулативно додавање. Органските бањи на располагање беа 8 ml и 25 ml. Пресметка: MG/4/100 = пресметка за големиот пловен објект MG/12,5/100 = пресметка за малиот сад Табела 2 ги прикажува пресметаните и користените раствори на залиха: Табела 2: Акции на раствори Супстанција Моларна маса MAH4 HCl 297,89 g/бања со органски волумен во почетната тежина на испитната супстанција (100 μmol/l)/ml органска бања 80, 74 Резервните раствори беа додадени на секои четириесет и пет минути со помош на микропипета од Фин и се мери ефектот. Додадените концентрации се прикажани во Табела 3 подолу. Табела 3: Претставување на шемата за пипетирање Додадена количина Конечна концентрација 3 μl 3 μmol/l 7 μl 10 μmol/l 20 μl 30 μmol/l 70 μl 100 μmol/l 11
21 Слика 4: Шематски приказ на срцето (Netter FH 2003) 16
23 освоија парче долг 3 см. Изолацијата требаше да се направи многу внимателно бидејќи може да ја повреди и пренапони аортата. Аортата, како и сите други препарати, потоа се става во сад Петри со Тирод и се фиксира на подлогата од плута со две иглички за исекување. Требаше да бидете сигурни дека тоа не е претерано опфатено. Околното ткиво, маснотиите и крвта беа внимателно отстранети и исечени на парчиња долги приближно 2 мм. Дефектните и неправилните делови беа отстранети. Слика 6: Шематски приказ на аортата (Netter FH 2003) 18
24 3.5 Употребени апарати Во експериментите се користеа два различни апарати. Во апаратот 1 беа спроведени експерименти за папиларни мускули и во апарат 2 експерименти со аортна, атријална и интестинална. Органите беа обесени на преобразувачи на сила преку сребрена жица. Трансдутерот на силата ја претвори механичката сила во електричен сигнал и ја пренесе на засилувач, кој го засили електричниот сигнал и го нацрта на графичка хартија со помош на пенкало. За да може да се споредат експериментите, секогаш требало да се работи под исти услови во однос на снабдување со кислород, температура, pH вредност, производство и состав на тиродот. Апарат 1 Апарат 1 се користеше само за експерименти врз папиларните мускули. Конструкција: Апаратот содржи водена бања изработена од акрилно стакло. Мускулна комора излегува во оваа водена бања. Исто така постои и статив на кој се прицврстени силниот трансдуцерот, финиот погон и држачот на органот. Погледнете ја слика 6. за подобро разбирање
25 Слика 7: Скица на апаратот 1 Мускулната комора содржи 25 ml, така што се користеше истиот волумен за Tyrode. Водената бања беше термостатски контролирана до константна 35 ° С. Ова создаде физиолошки услови. Хранливиот раствор мораше да се прилагоди на оваа вредност, поради што Тиродот беше ставен во комората 10 минути пред експериментот. Подготовката е претходно опишана во Поглавје. Подготовката на мускулот беше ставена во контакт со силите на силата со сребрената кука преку сребрена жица, папиларниот мускул беше затегнат помеѓу електродата и плексигласниот диск. Потоа држачот беше спуштен во мускулната комора така што примерокот стоеше целосно во Тиродот. Папиларните мускули не тепаат спонтано како атриумот, но мора да бидат стимулирани. Ова беше постигнато со стимулатор Accupulser (модел Isostim 301T. WPI, Хамден, КТ, САД). Контракцијата беше пренесена на силите на силата преку сребрената хлоридска жица, засилена со засилувачот и пренесена на рамното пенкало. 20-ти
26 Слика 8: Оригинална слика на апаратот Апарат 2 Апарат 2 (види слика 8) се користеше за тестовите на аортата, пулмоналната артерија, илеумот на терминалот и десниот атриум. Водената бања беше доведена до 37 ° С. Во случајот на аортата и пулмоналната артерија, примероците во форма на прстен беа прикачени директно на силите на трансдуцерот со помош на сребрена жица. Во цревата и атриумот, две сребрени куки беа претходно прицврстени на два краја и овие беа поврзани и со силата на трансдуцерот. Во апаратот 2, тест-предметите беа спуштени во органските бањи исполнети со тирод. Органските бањи беа исто така поставени на 37 C и беа извадени со гас. Беше нанесена претходна напнатост преку фин погон, потоа се изврши контракција и овие контракции или промени во нив беа претворени во тековни сигнали и беа снимени. 21-ви
27 Слика 9: Скица на апаратот 2 22
28 Слика 10: Оригинална слика на апаратот Конвертер на силата Со помош на конверторот на силата, механичките промени се претвораат во електрични преку таканаречен мост Wheatstone, што овозможува мерење. Постојат стрии во спроводникот на силата. Кога имаше промени во силата на контракција на органите, отпорноста на издолжување и протокот на струја исто така беа пропорционално променети. Промените во контракцијата и релаксацијата на мускулите може да се пренесат на рамно лежиште (Flatbed Recorder модел BD 112, од компанијата World Precision Instruments (WPI), Сарасота, ФЛ, САД) преку засилувач (Transbridge TM, 4-канален засилувач на трансдуцерот, од World Precision Instruments (WPI FL, USA), Сарасота, САД) Кип и Зонен). Ова ги пренесува импулсите на графичка хартија. 23
29 Слика 11: Скица на снабдувачот на силата Снабдување со карбоген Во сите експерименти, постојаното снабдување на органите со карбоген гас беше потребно за да се постигне доволно снабдување со кислород, рамномерна мешавина на активната супстанција и да се одржи ph вредноста константна. Ова беше овозможено со помош на систем на црева што беше поврзан со секоја бања со органи. Стаклените прженици беа веднаш пред влезот во бањите. Тие овозможија фина атомизација и, заедно со стегите на почетокот на цревата, оптимална доза на воздухот. Слика 12: Оригинална слика за снабдување со гас 24
33 KCl земени и растворени во 100 ml Tyrode. Тука постои и брза контракција, која исто толку брзо повторно се намали. Еден чекаше околу 45 минути додека не се формираше стабилна фаза на плато. Супстанцијата беше додадена повторно според познатата шема на пулмонална артерија (пулмонална артерија). Текот на експериментот беше ист како и за аортата, единствената разлика беше во напнатоста, која секогаш беше константна на 5 mV, т.е. 9,81 mn MAH 4HCL на цревата Истражувања со глибенкламид и нитро-Л-аргинин Цревото е подготвено како што е опишано во поглавјето и се стега со апаратот 2. За текот на експериментот, видете во поглавјето Овде се чекаше до фазата на постојана висорамнина, потоа беа додадени антагонистите глибенкламид или нитро-Л-аргинин, а крајната концентрација во органската бања беше 100 μmol/l. По 45 минути, беа додадени 15 μl раствор на суровини и им беше дозволено да дејствуваат уште 45 минути, по што експериментот заврши. Глибенкламид Слика 13: Глибенкламид (MW = 494,0 g/mol) 28
36 нулта линија. На тој начин можете пропорционално да ги споредувате вредностите. За ова, требаше да се земе предвид факторот на калибрација што одговараше на 5 mV за 1 cm или 0,98 mn. Ако работевте на 2 mv, вредноста требаше да се помножи со 0,2 и на 10 mv со 2 Статистика За статистичката проценка на силата на контракција и фреквенцијата на ударот, беа пресметани средните вредности и стандардната грешка на средните вредности (SEM). Програмата Сигма Плот 9.0 беше искористена за пресметување на овие статистички вредности и EC50. Оваа програма ја објаснува средната ефективна концентрација на активната состојка во mmol/l при која е достигната половина од контролната вредност. Со цел да се набудува веројатноста за грешка, беше извршен т-тест на Студентот за парни набудувања. Вредностите помалку од 0,1% (П 0,001) беа многу значајни и вредностите од 5% (П 0,05), 1% (П 0,01) беа значајни. Вредностите со веројатност за грешка> 5% (П> 0,05) не беа значајни вредности. 31
38 Табела 5: Резултати од тестот на MAH 4HCl на десната преткомора MAH4HCL f ± SEM f ± SEM (μmol/l) (x/min) (%) Број на обиди за веројатност за грешка (P) n Контрола 180 ± 8,66 0 ±, 50 ± 8,54 1,52 ± 2,60 4 ns, 50 ± 12,50-1,18 ± 5,08 4 ns ± 9,24-15,27 ± 3,87 4 0, ± ± 0 4 0,001 Во Табелата 5 дава аритметички просечни вредности (ѓ) во отчукувања/мин и во проценти, како и нивните стандардни грешки (СЕМ) за соодветната концентрација. n е бројот на обиди. 33
39 Дијаграм 1: Крива на концентрација-ефект на MAH4 HCl во десниот атриум AFRICAN n = 4 MAH 4 HCL EC 50 = 49 μmol/l 25 Намалување на фреквенцијата на ритамот (%) Заклучок (Μmol/l) Овој дијаграм ја покажува промената на фреквенцијата на ритамот како функција количината на супстанција во органската комора. Фреквенцијата на влијанието е внесена во% на y-оската и концентрацијата на испитната супстанција на x-оската. Вредноста на EC 50 беше прикажана со испрекинати линии и е 49 μmol/l. Точките ги покажуваат пресметаните просечни вредности на фреквенцијата на ритамот во соодветните концентрации, а прачките ги покажуваат нивните стандардни грешки. 34
40 Слика 15: Оригинално снимање на хронотропниот ефект на MAH4 HCl 12 сек 1 см = 0,98 мн Негативниот хронотропен ефект може да се прочита од бројот на отчукувања. 35
41 4.1.2 Musculus papillaris Беа извршени четири теста за да се процени инотропниот ефект врз папиларниот мускул. Контролната вредност беше 1,58 ± 0,45 мил. Додавањето на супстанцијата резултираше со намалување на силата на контракција. Во концентрација од 3 μmol/l, ова намалување беше -15,05 ± 8,34% и стануваше сè поголемо. При крајна концентрација од 100 μmol/l, силата на контракција беше 0,08 ± 0,02 mN или 94,92 1,58% од контролната вредност. Табела 6: Ефект на MAH 4HCl врз папиларниот мускул MAH4HCL fc ± SEM fc ± SEM (μmol/l) (mn) (%) Број на веројатност за обиди за грешка (P) n контрола 1,58 ± 0,45 0 ±, 23 ± 0 .43-15.05 ± 8,34 4 0 .99 ± 0,36-40,46 ± 5,70 4 0 .57 ± 0,19-65,92 ± 3,05 4 0,08 ± 0,02-94,92 ± 1,58 4 0,001 Оваа табела ги прикажува аритметичките средни вредности (fc) и нивната стандардна девијација (SEM) во присутна концентрација и во mn и во проценти. 36
42 Дијаграм 2: Крива на концентрација-ефект на MAH4 HCl на папиларниот мускул 0 PAPILLAR MUSCLE MAH 4 HCl n = 4 EC 50 = 15 μmol/l намалување на силата на контракција (%) конц. (Μmol/l) Овој дијаграм ја покажува промената на силата на контракција како функција на количината на супстанција во органската комора. Намалувањето на силата на контракција во% е внесено на y-оската и концентрацијата на тест супстанцијата во μmol/l на x-оската. Вредноста на EC 50 беше прикажана со испрекинати линии и е 15 μmol/l. Точките ги покажуваат пресметаните просечни вредности на силата на контракција во соодветните концентрации, а прачките ги покажуваат нивните стандардни грешки. 37
43 Слика 16: Оригинално снимање на инотропен ефект на MAH4 HCl 1 cm = 0,98 mn Намалувањето на силата на контракцијата може јасно да се види во должината на амплитудата. Должината на амплитудата се намалува со зголемување на концентрацијата на испитната супстанција во органската комора, што се базира на негативниот инотропен ефект на испитната супстанција. 38