Влијанието на холестеролот врз подвижноста на надворешните клетки на косата на кохлеата на морско свинче
Влијанието на холестеролот врз подвижноста на надворешните клетки на косата на кохлеата заморче и врз моторниот протеин прстин Јоханес Мајкл Шмид
Од клиниката и поликлиниката за медицина на ушите, носот и грлото на Универзитетот Лудвиг Максимилијанс во Минхен Директор: проф. медицински Александар Бергхаус Влијанието на холестеролот врз подвижноста на надворешните влакна на клетките на морско свинче Кохлеа и на моторниот протеин престин дисертација за стекнување на докторска диплома по медицина на Медицинскиот факултет на Универзитетот Лудвиг Максимилијанс во Минхен презентиран од Јоханес Мајкл Шмид од Минхен во 2011 година
Со одобрение на Медицинскиот факултет на Универзитетот во МЦнчен Известувач: Ко-известувач: Прив.-Доз. Д-р медицински М. Канис Проф. Д-р. Магдалена Гац Проф. Франк Штуб Дин: Проф. медицински Д-р х.ц. M. Reiser, FACR, FRCR Ден на устен испит: 09.06.2011 година
I Содржина Содржина Страна I. Вовед. 1 1. Важноста на слухот. 1 2. Анатомија на внатрешното уво. 2 3. Физиологија на кохлеата. 5 3.1 Пренос на звук и тонотопија. 5 3.2 Ендоколеарен потенцијал и механоелектрична трансдукција. 5 3.3 Засилување на сигналот од надворешните клетки на косата. 7 3.4 Пренос на информации преку внатрешните клетки на косата. 11 4. Моторен протеин престин и фина структура на клеточната мембрана на надворешните клетки на косата. 11 4.1 Идентификација на Престин. 11 4.2 Фина структура на клеточната мембрана на надворешните клетки на влакната. 12 4.3 Структурна структура и локализација на престинот. 13 4.4 Функција на Престин. 15 5. Нелинеарна капацитивност и електромотолност на надворешните клетки на косата. 16 6. Холестерол и неговото влијание врз процесот на слухот. 17 6.1 Хемиска структура и општо значење. 17 6.2 Важноста на холестеролот за плазматската мембрана. 19 6.3 Ефекти на холестерол врз внатрешното уво. 20 7. Прашања и цели. 24 II. Материјал и методи. 26 1. Материјал. 26 1.1 Уреди. 26 1.2 Потрошен материјал. 27 1.3 Хемикалии и раствори. 27 1.3.1 Хемикалии. 27 1.3.2 Решенија. 28 1.4 Софтвер. 29
III Содржина 2. Подвижност на надворешните клетки на косата под физиолошки услови. 53 3. Влијание на холестерол врз подвижноста на надворешните клетки на косата. 55 3.1 Општи размислувања. 55 3.2 Зависност на подвижноста на надворешните клетки на косата од концентрацијата на холестерол. 56 3.2.1 Влијание на холестеролот врз максималното скратување и максималното издолжување. 56 3.2.2 Влијание на холестеролот на максималниот наклон, на просечните промени во должината и на напонот V pcc. 58 3.3 Влијание на холестерол врз моторниот протеин престин и врз клеточната мембрана на надворешните клетки на косата. 60 3.3.1 Влијание на хлорид врз подвижноста на надворешните клетки на косата. 60 3.3.2 Влијание на холестерол со полумаксимална функција на престин. 62 V. Резиме и изгледи. 64 VI. Список на кратенки. 68 VII. Список на слики. 69 VIII. Список на табели. 71 IX. Библиографија. 72 X. Признанија. 78 XI. Публикации. 79 XII. Продолжи 81
I. Вовед 4 Слика 1: Анатомија на внатрешното уво А: Преглед со отсечена отворена кохлеа Б: Пресек низ намотките на кохлеата Ц: Шематски приказ на органот на Корти со надворешните и внатрешните клетки на косата (изменето од Хадспет 2000 и Книрш 2007) (Книрш 2007) )
7 I. Воведувањето варира помеѓу -60 mv и -80 mv (Rajagopalan et al. 2007) (Слика 3). Движечка сила зад овие јонски струи е потенцијалната разлика помеѓу мембранскиот потенцијал на влакненцата и ендокохлеарниот потенцијал (Клинке и др. 2005; Шмит 2007; Спекман и др. 2008). Слика 3: Потенцијал на рецепторот како функција на отклонување на стереовилите (изменето од Спекман и др. 2008 и Рајагопалан и сор. 2007 година) 3.3 Засилување на сигналот од надворешните клетки на косата Приливот на јони во ЕТЦ и придружните промени во потенцијалот ја активираат функцијата за засилување на ÄHZ (Бренеман и сор. 2009). Оваа функција за засилување се заснова на два механизма, соматска и цилијарна подвижност. Двата механизми ги зголемуваат вибрациите на патниот бран до 1000 пати со активни движења на EHZ (Шмит 2007; Далос 2008). Во цилијарната подвижност, ова се случува преку активни движења на стереовилите, додека соматската подвижност се заснова на издолжување и скратување на клеточното тело. Овој механизам, познат како коклеарен засилувач, ја зголемува селективноста и чувствителноста на фреквенцијата на слушниот орган. Дали ÄHZ се ототоксични супстанции
I. Вовед 10 Слика 5: Цилијарна подвижност (изменето од Fettiplace 2006 и Breneman et al. 2009) Земајќи ги заедно тековните резултати од истражувањето, Хадспет предложи дека цилијарната подвижност претставува еден вид на засилувач и фреквентен модулатор, додека соматската подвижност делува како последен засилувач може (Хадспет 2008). Кохлеарниот засилувач работи динамично. Тој нуди можност за засилување на многу слаб интензитет на звук, додека големиот интензитет на звук се обработува без засилување. Ова спречува оштетување на внатрешното уво. Автоматската контрола на добивката во форма на инхибиторни ефекти обезбедува механичка рамнотежа. Најдобриот истражуван инхибиторен ефект е со посредство на невротрансмитерот ацетилхолин. Ацетилхолинот е главниот пренесувач на еферентните влакна кои го инервираат EHZ. Со врзување за специфични рецептори, Ca 2+ тече во клетката. Ова доведува до одложен одлив на К + и со тоа до хиперполаризација на клетката. Ова доведува до намалување на чувствителноста на напонот на EHZ и инхибиција на електромоторноста (Фроленков 2006; Ашмор 2008).
12 I. Вовед. Либерман и сор. беа во можност да ја потврдат оваа теорија во 2002 година. Тие покажаа дека кога егзоните 3-7 од кодот за кодирање беа избришани, глувците имаа загуба на дисторзивните производи на отоакустичните емисии (DPOAE) и електромотилноста на EHZ, како и зголемување на прагот на слухот од 40-50 dB (Liberman et al. 2002). 4.2 Фина структура на клеточната мембрана на надворешните клетки на косата Моторниот протеин престин скоро исклучиво се наоѓа во страничната клеточна мембрана на ÄHZ (Ashmore 2008) (Слика 6). Слика 6: Структура на страничната клеточна мембрана на надворешната клетка на влакната (изменета од Огалаи и др. 1998) На апикалниот крај на ЕТЦ, стереовилите се прицврстени на кутикуларната плоча. Јадрото е во основата на клетката. Клеточната мембрана на страничниот wallид има единствена трислојна структура. Надворешниот слој е плазма мембрана (ПМ), во која се вградени 3000 до 6000 престински молекули на μm². Густината на престин зависи од локацијата на ЕТЦ во кохлеата. Апикална ЕХЗ дека
I. Вовед 14 Тридимензионална реконструкција на Престин од Мио и сор. резултираше со протеин со димензии 7,7 nm x 7,7 nm x 11,5 nm во форма на пиштол во форма на куршум со внатрешни шуплини (Mio et al. 2008) (Слика 8). Слика 7: Шематски приказ на структурата и локализација на престинот во плазматската мембрана на надворешните клетки на косата (изменето од Ешмор 2008) Слика 8: Тридимензионална претстава на престин во плазматската мембрана (изменета од Мио и сор. 2008)
17 I. Вовед Споредба со истраги за промени во должината на ÄHZ со други методи, на пр. видео микроскопија користена во оваа работа (Ешмор 2008). Слика 10: Графички приказ на NLC, движењето на полнежот и промената на должината како функција на потенцијалот на мембраната (изменето од Ashmore 2008) Многу фактори, како на пр. статусот на фосфорилација на интрацелуларните протеини или супстанции како што се хлороформ, гадолиниум, салицилати или холестерол може да влијае на овие процеси. Овие кривини ги менувате или во насока на деполаризација или во хиперполаризација или ја менувате количината на најголема промена во должината или најголемо движење на полнежот. Во оваа работа, специфично беше испитано влијанието на холестеролот врз подвижноста на EHZ (Ashmore 2008). 6. Холестерол и негово влијание врз процесот на слухот 6.1 Хемиска структура и општо значење Нобеловецот Мајкл Браун го опиша холестеролот како молекула на чело на Јанус (Берг и сор. 2007). Од една страна тоа е неопходен дел од нашите клетки, од друга страна го оштетува човечкиот организам на пр. поради атеросклероза (Yeagle 1985). Холестеролот претставува суштински дел од плазматската мембрана на повеќето
25 I. Вовед За да може да се прави разлика помеѓу холестеролот на клеточната мембрана и на моторичкиот протеин престин, функцијата на престин на ЕТЦ мора да се намали со намалување на концентрацијата на интрацелуларниот хлорид на околу 50% (Оливер и сор. 2001). ЕТЦ со половина од функцијата на престин потоа се поделени во две тест групи. Првата група се испитува со екстрацелуларна концентрација на холестерол од 1,0 mmol/l, втората група без додаден холестерол. Евалуацијата на овие експерименти потоа треба да одговори на прашањето дали влијанието на холестеролот е повеќе резултат на ефекти врз пасивните својства на клеточната мембрана или се базира повеќе на ефект врз функцијата на моторниот протеин престин.
II. Материјал и методи 26 II. Материјал и методи 1. Материјал 1.1 Подготовка на опрема Стереомикроскоп ладен извор на светлина Подготовка на раствори Осмомат 030 Leica Microsystems GmbH, Вецлар, Германија Schott AG, Мајнц, Германија Gonotec GmbH, Берлин, Германија Пипети Референтен Хамбург, Епендорф АГ, Држач за маса-засилувач-затегнувач-стимулација-засилувач-маса/Држач за пипета за засилувач-засилувач-засилувач/засилувач на фарадејски кафез/Предзасилувач DMZ-Universal Puller Micro-g Axopatch 200A CV-201A Headstage Германија ZeH, Германија TMC, Пибоди, м-р, САД Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA
27 Аналогно-дигитален конвертер Digidata 1200 Micromanipulator Model XR-6 Видео-снимки Микроскоп Axiovert 135 Видео камера Moticam 2000 II.Материјал и методи Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA Narishige Scientific Instrument Lab., Токио, Јапонија Carl Zeiss AG, Gtinttingen, Германија Motic Deutschland GmbH, Вецлар, Германија 1.2 Потрошен материјал за врвови на пипети 10 μl, 100 μl, 1000 μl боросиликатни стаклени капилари GC150TF-10 Петри сад поли-Л-лизин обложен (Ø 35 mm) Eppendorf AG, Хамбург, Германија Кларк електромедицински инструменти, Pangbb Ридинг, Велика Британија Greiner Bio-One GmbH, Фрикенхаузен, Германија 1.3 Хемикалии и раствори 1.3.1 Хемикалии натриум пентанесулфонатен растворлив во вода холестерол HBSS (раствор на баланс на соли на Ханкс) Сигма-Олдрич копродукции, Сент Луис, М.С., Сигма-Олдрих Ко., Св. Луис, МО, САД Biochrom AG, Берлин, Германија
II. Материјал и методи 28 1.3.2 Раствори Пипетни раствори (интрацелуларни раствори) (во mmol/l) Супстанција Стандарден раствор Раствор со 6 mmol/l хлорид KCl 140 6 Натриум пентанесулфонат 0 134 MgCl 2 6H 2 0 2 2 EGTA 11 11 CaCl 2 0, 1 0,1 хепес 10 10 KOH за поставување на ph вредност од 7,2 глукоза за поставување на осмоларност на раствори за бања од 315-320 момол/л (вонклеточни раствори) (во mmol/l) супстанциски раствори на раствори со (раствор на HBSS) 0,1 mmol/l, 0,5 mmol/l, 1,0 mmol/l, 1,5 mmol/l холестерол 0 холестерол CaCl 2 1,25 1,25 гликоза 5,55 5,55 KCl 5,4 5, 4 KH 2 PO 4 0,35 0,35 MgSO 4 7H 2 O 0,81 0,81 NaCl 137 137 Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,34 0,34 Хепес 5 5 NaOH за поставување на ph вредност од 7,2-7,4 гликоза за прилагодување на осмоларноста на 300-310 мосмол/л
II.Материјал и методи 32 Слика 13: Конфигурации за мерење на техниката на далноводи и нивно производство (изменето од Numberger 1996) 1. Конфигурација приложена на ќелија: Конфигурацијата прикачена на ќелијата одговара на почетната позиција за сите други конфигурации. Во оваа конфигурација не е можно да се интервенира во интрацелуларната средина на клетката. Клетката се мери во состојба во која сите протеини, вклучувајќи ги и јонските канали, се наоѓаат во нивната природна средина на интрацелуларната страна на мембраната. Само подрачјето под пипетата, лепенката, е контролирано од екстрацелуларниот потенцијал на засилувачот.
II. Материјал и методи беше опремена 34 подвижна маса за микроскоп. Зголемената слика е снимена со дигитална видео камера (Moticam 2000, Motic Deutschland GmbH, Вецлар, Германија) и се чува дигитално на компјутер. Хидрауличен микроманипулатор (модел XR-6, Наришиге научен инструмент лабораторија. Токио, Јапонија) беше искористен за позиционирање на лепенката пипета. Електродата за капење во внатрешноста на пепетата за лепенки беше поврзана со засилувач (сцена на главата CV-201A, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, САД). Слика 14: А: Структура на мерната станица за затегнувачот Б: Зголемување на табелата со микроскоп со сад Петри и лепенка пипета (изменета од Шеел 2002) (Шеел 2002) Негативниот притисок потребен за аспирација на клетките е создаден од шприц за перфузор поврзан со држачот на пипетата. Предзасилувачот беше поврзан со засилувач (Axopatch 200A, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA),
37 II. Материјал и методи 2.2.6 Мерење на отпорноста на електродата и корекција на офсет Пипетата беше исполнета и стегната во држачот на пипетата така што врвот на пипетата беше потопен во растворот за бања. Мал преголем притисок спречи пипетата да се затне од вовлечени честички. Програмата прицврстувач 8 генерираше негативен тест пулс со напон од 5 mV во период од 5 ms. Од добиениот сегашен одговор, програмата ја пресмета тековната отпорност на електродата врз основа на законот на Ом. Овој отпор беше помеѓу 3 MΩ и 6 MΩ при тестовите (Слика 15 А). Слика 15: Промена на отпорноста и реакцијата на струјата на тест-пулсот предизвикан од лепенката-пипета како функција од конфигурацијата на апаратот за заптивка за лепенка (изменета од Numberger 1996)
II. Материјал и методи 38 Напоните што не доаѓаат од ќелијата или од тест пулсот се нарекуваат потенцијали за офсет (Numberger 1996). Овие потенцијали активирани од поларизација на електродите на сребро/сребро хлорид и со потенцијали на транзиција помеѓу различните концентрации на електролити во бањата и пипетата можат да ги фалсификуваат резултатите од мерењето. Овие потенцијали мора да се компензираат со помош на засилувачот на далноводи пред секое мерење и не треба да надминуваат 10 mV (Numberger 1996). 2.2.7 Прицврстувач на целосна ќелија и стимулација Соодветни витални клетки беа избрани под микроскоп при мало зголемување. Критериумите за виталност на Зајиќ и Шахт (Зајиќ и др. 1987) беа искористени за проценка на клетките. Клетките покажаа стереовили со тврд изглед, клеточно јадро лоцирано на базалниот пол, мали, случајни движења на цитоплазматските честички и постојана непроменета клеточна мембрана (Слика 16). Слика 16: Изолирана надворешна клетка за коса со остатоци од потпорно ткиво и крпеница