Влијанието на ткивните макрофаги врз метаболичките болести - PDF бесплатно преземање
1 Влијанието на ткивните макрофаги врз метаболичките болести МАСТЕРСКА ТЕЗА за да се добие академска диплома Магистер на науки на Универзитетот за применети науки во Универзитетот во Хамбург, Факултет за оддел за биотехнологија на животни науки проф. Оливер Улрих Др. Андре Броерман поднесено од: Кристијан Дикел Вторник, 13 ноември 2012 година
2 Универзитет за применети науки во Хамбург Факултет за животни науки Оддел за биотехнологија Лохриггер Кирштрасе Хамбург во соработка со: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Birkendorfer Strasse Biberach an der Riss Автор: Кристијан Дикел Датум на поднесување: Прв испитувач: Втор испитувач: Проф. Др. Оливер Улрих Др. Андре Броман
3 содржина 1. Вовед. VI 1.1 Дебелина и отпорност на инсулин. VI 1.2 Еволутивна перспектива. VIII 1.3 Макрофаги кај метаболички заболувања. Х подтипови на макрофаги. X Трансендотелијална миграција на макрофагите. XIII Улога на CCR2 и MCP-1 при регрутирање на макрофаги. XIII 1.4 Маркери на бели крвни клетки за анализа на FACS. XV 1.5 модели на животни. XVI Глувчето ОБ/ОБ. XVI Глувчето db/db. XVII глувче ДИО. XVII 1.6 Опции за третман на дијабетес тип II. XVIII 1.7 Цел. XXII 2. Материјали и методи. XXIII 2.1 Материјали. XXIII Потрошен материјал. XXIII Користена опрема. XXIII хемикалии. XXIV антитела. XXVI мешавини за добиточна храна. XXVI 2.2 Методи. XXVII подготовка на ткиво. XXVII изолација на клетките. Број на клетки XXVII. XXVII имунофлуоресцентно боење. XXVIII Анализа на сортирач на активирани клетки со флуоресценција (FACS). XXIX III
4 2.2.6 Евалуација. ХХХ тест за толеранција на инсулин (ITT). XXXI тест за толеранција на орална гликоза (огт). XXXII анализа на цитокин. XXXII животни. XXXIII статистика. XXXIII 3. Резултати. XXXIV 3.1 Воспоставување стратегија за обработка на глувско, епидидимално масно ткиво за анализа на FACS на банкомати. XXXIV 3.2 Воспоставување метод FACS за квантитативна анализа на леукоцити. XXXV тандем панел (панел за 4 лица). ХХВ анализира со 3-пати боење. Комбиниран панел XXXVI (панел од 4). XLI 3.3 тест на системот. XLIV леукоцити во генетски модел на дијабетес. Споредба на методот XLIV. XLIV анализа со 3 панели. XLVII анализа со комбиниран панел. Споредба на резултатите од ЛИ. LII леукоцити во модел на дијабетес предизвикан од диета. LIII 3.4 Субхронична студија на CCR2 антагонист кај глувци huccr2. LVI леукоцити. Концентрација на LVI во крвната плазма на MCP-1. Метаболни параметри на LXII. LXIII 4. Дискусија. LXV 4.1 Воспоставување анализа на FACS за квантификација на вкупни и проинфламаторни макрофаги во глувско масно ткиво. LXV тандем панел. Комбиниран панел LXV. Трикратно боење на LXV. LXVI M1/M2 панел. LXVI IV
5 4.2 Споредба на методот. LXVII 4.3 Генетски модели на глувци. LXVIII 4.4 Модел на исхраната предизвикана од дебелина (ДИО). LXX 4.5 Споредба на моделите на дебелина. LXXI 4.6 Зголемен број на банкомати кај дебели глувци. LXXII 4.7 антагонизам CCR2 како терапевтска опција за дијабетес тип II. Броеви на банкомати LXXIII пред третман на супстанции. LXXIII Антивоспалително дејство на пиоглитазон во моделот ДИО. Антагонизам на LXXIV CCR2 без антиинфламаторно дејство во масното ткиво во тестисите. LXXIV Однос помеѓу воспаление на масното ткиво и метаболичките параметри во овој експеримент. LXXV 5. Изглед. LXXVI 6. Резиме. LXXVII 7. Список на кратенки. LXXVIII 8. Список на слики. LXXXI 9. Список на табели. LXXXIV 10. Библиографија. LXXXV 11. Додаток. LXXXIX 11.1 Листови со податоци за мешавини на храна. LXXXIX лист со податоци за добиточна храна. LXXXIX лист со податоци за диета со многу маснотии. XC лист со податоци за нормална исхрана. XCI 11.2 FACS протокол на Др. Чавакис на ТУ Дрезден. Извештај за XCII. XCVII благодарам XCVIII V
9 1. Вовед Слика 2: Еволуција на масното ткиво, црниот дроб и хематопоетскиот систем кај одделни органи кај цицачи Кај Дрософила меланогастер, масното ткиво, црниот дроб и хематопоетскиот систем се комбинираат во функционална единица наречена масно тело. Ова потекло на развој се рефлектира во сличната структура на хомолозите кај цицачите. Ефектите на адипоцитите во масното ткиво и хепатоцитите во црниот дроб врз соодветните имунолошки клетки, макрофагите и клетките Купфер, се многу слични. Покрај тоа, постои тесна врска помеѓу имунолошкиот систем и одговорите на метаболичкиот систем, што се рефлектира во директен пристап на двете ткива до мрежата на крвните садови. (Хотамислигил, 2006) 9
10 1. Вовед 1.3 Макрофаги во метаболички заболувања Подтипови макрофаги Во 2003 година, за прв пат беше објавена врска помеѓу инсулинска резистенција поврзана со дебелина и хронично воспаление во масното ткиво, изразена во форма на акумулација на макрофаги во бело масно ткиво (Вајсберг и др., 2003; Xu et al., 2003). Макрофагите се диференцирани моноцити кои се развиваат од прогениторни клетки на 'рбетниот мозок. Затоа припаѓаат на циркулирачките бели крвни клетки. И моноцитите и макрофагите се хетерогени популации на клетките. Првично беа дефинирани два подтипа макрофаги: класично активираните проинфламаторни М1 макрофаги и алтернативно активираните М2 макрофаги (Гутиерез и сор., 2009; Шипер и сор., 2010) Кај цицачите со нормална тежина, леукоцитите се наоѓаат во масното ткиво, црниот дроб, мускулите и панкреасот. Нивниот фенотип одговара на оној на макрофагите М2, кои се вклучени во хомеостазата на ткивата (Lumeng et al., 2007c; Lumeng et al., 2008; Odegaard et al., 2008; Olefsky & Glass, 2010; Lumeng et al., 2007b). Притоа, тие лачат антиинфламаторни цитокини како што се интерлеукин (IL) -10, IL-4 и IL-13 (слика 3). 10
11 1. Вовед Слика 3: Поларизација на макрофагите во инсулинска резистенција предизвикана од дебелина во масно ткиво Во услови на нормална тежина, адипоцитите лачат фактори како што се интерлеукин (IL) -13, што предизвикува алтернативно активирање на макрофагите. Алтернативно активираните (М2) макрофаги лачат антиинфламаторни медијатори како што е IL-10. Овие антиинфламаторни цитокини позитивно влијаат на чувствителноста на инсулин. Дебелината предизвикува промени во метаболизмот на адипоцитите и во генската експресија на цитокините. Ова доведува до зголемена липолиза и ослободување на проинфламаторни слободни масни киселини (ffas) и фактори кои регрутираат и активираат макрофаги. Такви фактори се моноцитниот хемотактички протеин-1 (MCP-1) и факторот на некроза на туморот α (TNFα). Класично активираните М1 макрофаги произведуваат големи количини на проинфламаторни медијатори како што се TNFα, IL-1β и резистин, кои делуваат на адипоцитите и со тоа предизвикуваат отпорност на инсулин. На овој начин, се воспоставува само-зајакнувачки маѓепсан круг што дополнително ја зголемува воспалението и инсулинската резистенција. (Olefsky & Glass, 2010; Слика 2, стр. 223) 11
23 2. Материјали и методи 2. Материјали и методи 2.1 Материјали Опис на потрошен материјал Производител # Производ бр. Ракавици Нитрил Кимберли-Кларк # 90627 Цевки за микрореакција епендорф # Цевки за безбедно заклучување (0,5, 1,5, 2,0 мл) епендорф # епендорф # Совети за пипети епендорф # (20, 200, 1000, 5000 μл) епендорф # епендорф # епендорф # Совети за матрична пипета Thermo Scientific # 7281 Пипети за еднократна употреба резервоар за реагенс VWR # Цевка за центрифугирање (15, 50 мл) зеленило # 188271, мл-цевки BD Falcon # чинија со длабоко заоблено дно BD сокол # Петри сад BD сокол # Комори за броење за еднократна употреба клетки за течност за испитување на гликоза # 10283 Zellstrayner Fisherbrand # Користени уреди Опис Производител Аналитички биланс Производител Аналитичка рамнотежа AC211S Сарториус рамнотежа A30 Метлер инкубатор BBD 6220 Heraeus навален шејкер PTR-30 Грант-био Центрифуга во фрижидер Heraeus Megafuge 40R Thermo Научни пипети 2, 10, 20, 100, 200, 1000, 5000 или 5000
24 2. Материјали и методи Матрични пипети 1250 Matrix Impact 2 Thermo Scientific pipetting aid accu-jet BRAND безбедносни кабинети Hera Safe Thermo Scientific центрифуга за бендови 5417C епендорф Vortexer VF2 Janke & Kunkel counter counter Countess invitrogen Флуоресценција активиран мобилен сортирач MACS Quant MiltenoseSE Biotech Име на хемикалии Cobas Integra 400 plus Roche Bacillol plus производител # Производ бр. BODE RPMI 1640 со глутамин лонза # 4464 фетален говедски серумски биолошки индустрија # 04-001AUS-1A Dulbecco s Phophate Buffered Saline Lonza # 6716 Collagenase Sigma # C0130 trypan blue invitrogen # T10282 Вклучувајќи пуфер MACS пуфер # Раствор на средство Раствор за белење MACS пуфер # амониум хлорид EDTA Sgima AG Sigma #EG калиум хидроген карбонат натриум хлорид MERCK # калиум хлорид MERCK # диодиум хидроген фосфат MERCK # магнезиум сулфат MERCK #
25 2. Материјали и методи Калциум хлорид Сигма # CG Калиум дихидроген водород фосфат MERCK # Hepes Fluka # 54466 Натриум хидроген карбонат MERCK # глукоза Сигма-Олдрич # 15,896-8 Пиоглитазон CCR2 антагонист Такада произведе внатрешно пуфер за хемолиза 150 mm NH 4 Cl 250 Km EDTA: Раствор 1 (4-пати) 137 mm NaCl 5,36 mm KCl 0,34 mm Na2HPO4 0,81 mm MgSO4 1,26 mm CaCl2 0,44 mm KH2HPO4 Раствор 2 (4-пати) 10 mm Hepes 4,17 mm NaHCO3 Измешајте 1 дел од растворот 1 и 2 со 2 дела двојно-дестилирана вода и прилагодете ја pH на 7,3 со NaOH на температура на раствор од 4 ° C. 25-ти
26 2. Материјали и методи Ознака на антитела Производител # Производ бр. Анти-глушец на PE стаорец ЦД45 БД Фарминген # ПЕ стаорец IgG2b, κ Изотип Контрола на БД Фарминген # АПЦ Стаорец против глушец ЦД11б БД Фарминген # АПЦ стаорец IgG2b, κ Изотип Контрола БД Фарминген # ПЕ-Ци 7 хрчак Анти-глушец ЦД11ц БД Фарминген # PE-Cy 7 Hamster IgG1, λ1 Control isotype Control BD Pharmingen # PE Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # PE Hamster IgG1, λ1 Control isotype BD Pharmingen # FITC Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # FITC Hamster IgG1, λ1 Control isotype BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Rat Anti-Mouse CD45 BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # Rat Anti-Mouse F4/80 Antigen: FITC Rat IgG2b Негативна контрола: FITC AbDserotec # MCA497FB abdserotec # MCA1125FT FC Block RAT Rat -Мус CD16/CD32 BD Фарминген # Мешавини за добиточна храна Чување храна за храна Kliba Nafag #% kcal диета со висока содржина на маснотии Истражувачки диети # D% kcal Диета за контрола Истражувачки диети # D12450B Соодветните листови со податоци за мешавините на храна може да се најдат во додатокот (Дел 11.1) 26-ти
31 2. Материјали и методи Пресметка на концентрацијата на банкомати во масното ткиво: Пресметка на процентот на макрофаг во SVF: Тест за толеранција на инсулин (ИТТ) Тестот за толеранција на инсулин (ИТТ) се нарекува и тест на инсулин хипогликемија и се користи за откривање на инсулинска резистенција. По инјекција на инсулин, се забележува значително намалување на концентрацијата на шеќер во крвта кај здрав организам. Ако постои инсулинска резистенција, падот на гликозата во крвта како одговор на администрацијата на инсулин се намалува. Theивотните постат два часа пред почетокот на експериментот. По овие два часа, непосредно пред апликацијата за инсулин, се зема вредноста на постот. Инсулинскиот раствор се дава на животните т.е. применети (на пример, 0,5 IU/kg). На моменти 10, 20 и 120 минути по администрација на инсулин, нивото на шеќер во крвта кај животните се мери со ленти за мерење на шеќер во крвта и мерен уред од Gluko Smart Swing. Ова е направено со употреба на капиларна крв од врвот на опашката. 31
33 2. Материјали и методи Animивотни Сите експерименти врз животни се извршени во согласност со упатствата на регионалниот совет на Тибинген. Глувците биле сместени во околина без патогени под стандарден светлосен циклус (12 часа светло/темно) со слободен пристап до вода и храна. Theивотните биле нарачани од vанвие. Во овој проект беше искористена диета со многу маснотии за да се предизвика отпорност на инсулин. За оваа цел, на глувците C57BL/6J им беше дадена диета D12451 (20% kcal протеин, 35% kcal јаглехидрати, 45% kcal маснотии) и соодветна контролна диета D12450B (20% kcal протеин, 70% kcal јаглехидрати, 10% kcal маснотии) од истражувачки диети со иста количина на kcal во вкупно напорена статистика Статистичката анализа е извршена со софтверот Prism Version 5.0 за Windows од Graphpad. Т-тестот беше искористен за споредување на две групи. За групна анализа со повеќе од две групи, анализата беше извршена со помош на ANOVA и тест на Данет. В вредностите од 0,05 се сметаа за значајни. Значењето беше означено на следниов начин: * одговара на p 0,05, ** одговара на p 0,01 и *** одговара на p 0,
37 3. Резултати A B C Слика 8: Контрола на изотипот на панелот за макрофаг со Rat IgG2b κ-pe, Rat IgG2b-FITC и Rat IgG2b κ-apc A Во точката со точки на SSC наспроти FSC, дефинирана е порта P1 (црвена), што покажува SVF. Сигналите B PE и FITC од оваа порта P1 дополнително се анализираат во точката. А посебна популација која е позитивна за обете ознаки е затворена како CD45 + F4/80 + (зелена). C Овие двојно позитивни клетки се цртаат спротивно на нивниот сигнал АПЦ во хистограмот и позитивниот сигнал (розова) ги прикажува тројно позитивните макрофаги на SVF. Дефинирана е специфична популација на клетки CD45 + F4/80 + (Слика 7Б). Двојно позитивните ќелии се испитуваат во APC каналот за специфичен CD11b позитивен сигнал (Слика 7C). Овие тројно позитивни клетки се макрофаги. Соодветната контрола на изотипови покажува, како што се очекуваше, само многу низок неспецифичен сигнал и за точката на точката PE/FITC (Слика 8B) и за хистограмот APC (Слика 8C). 37
39 3. Резултати ABCD Слика 10: Контрола на изотипот на проинфламаторниот панел за макрофаги со IgG2b κ-PE, Rat IgG2b κ-апк и Хрчак IgG1 λ1-фитц А Во точката со точки на SSC против FSC, дефинирана е порта P1 (црвена), што е SVF мапи. B PE сигналот на оваа П1 порта е дополнително анализиран во точката. ЦД45 позитивните ќелии (сина) се затворени и Ц прикажани во хистограмот наспроти нивниот сигнал АПЦ. Позитивниот сигнал (розев) потоа е затворен со Д во однос на сигналот FITC. Тројно позитивните проинфламаторни макрофаги на SVF (зелена) може да се анализираат на овој начин. PE сигналот на анти-cd45 антитело покажува облачни два точки кои можат јасно да се разликуваат едни од други (слика 9Б). Две јасно дефинирани врвови, исто така, може да се видат во хистограмот на АПЦ (слика 9С). Во контролата на изотипот, нема неспецифични врски во ниту еден канал (СЛИКИ 10Б и 10С). Сепак, двојно позитивните ќелии покажуваат голема бучава во позадината за емисија на флуоресценција во каналот FITC (Слика 9Д). Сепак, сите неспецифични сигнали можат да бидат исклучени преку поставената порта (Слика 10Д). 39
41 3. Резултати F4/80 + CD11b + клетките формираат посебна популација на клетки во дијаграмот FITC/APC (Слика 11Б). Овие двојно позитивни макрофаги формираат и негативен и позитивен сигнал во хистограмот на ПЕ (Слика 11C). И во портата за макрофаги и во затворените ЦД11ц + клетки се за контрола на изотипот без сигнал (Слика 12Б и 12С). Комбиниран панел (панел од 4) Бидејќи анализата на четирите клеточни маркери во панелот за антитела има големи предности како што е помала потрошувачка на антитела и помалку време отколку со анализата на две 3-пати боење на панелот за макрофаги и проинфламаторни макрофаги значи дека панелот со F4/80-FITC, CD11b-APC и CD11c-PE е проширен со анти-CD45 антитело со ознака Alexa Fluor 700. Сл. 13 го покажува спектарот на емисии на употребените четири ознаки. Комбинацијата на овие флуорохроми треба да биде можна бидејќи спектрите на емисии не се преклопуваат во нивните максимуми. Слика 13: Флуоресцентни спектри на комбинираниот панел (панел од 4) со FITC, PE, APC и Alexa Fluor700 41
42 3. Резултати Резултирачката структура на портата за анализа на макрофагите и проинфламаторните макрофаги е прикажана подолу (Слика 14). Соодветната контрола на изотипови може да се види на слика 15. A B C D Слика 14: Гејтс на 4-насочен панел со антитела со CD45-Alexa700, F4/80-FITC, CD11b-APC и CD11c-PE A Во точката со точки на SSC против FSC, дефинирана е порта P1 (црвена), што претставува SVF. B Alexa Fluor700 и FITC сигналите од оваа порта P1 дополнително се анализираат во точката. А посебна популација која е позитивна за обете ознаки е затворена како CD45 + F4/80 + (сина). Овие двојно позитивни ќелии се цртаат спротивно на нивниот APC сигнал во хистограмот C и позитивниот сигнал (розова) претставува тројно позитивни макрофаги на SVF. Овие макрофаги се испитуваат за нивниот PE сигнал во понатамошен хистограм. Позитивните проинфламаторни макрофаги CD11c на SVF затворени низ зелената порта можат да бидат поврзани директно со макрофагите на SVF од истиот примерок при едно мерење. 42