Воспоставување и анализа на нокаут модели на глувци на σ1 под-единици на комплексот АП-1 - PDF
Воспоставување и анализа на нок-аут модели на глувци на σ1-под-единиците на АП-1 сложената дисертација за добивање на докторски степен на математичко-природните научни факултети на Георг-август-универзитет зу Гатинген претставена од ennенифер Балтес од Саарбрукен Гатинген 2008
Д7 Говорник: Проф. Др. K. von Figura Институт за биохемија II, Центар за биохемија и биологија на молекуларна клетка на Универзитетот Георг-Август во Гетинген, ко-предавач: проф. Институт за микробиологија и генетика Р. Фикнер на универзитетот Георг-Август во Гетинген Ден на усно испитување: 22 јануари 2008 година
Содржина I Содржина 1. Вовед. 1 1.1 Везикуларен транспорт. 1 1.1.1 Клатрин. 4 1.1.2.1 АП-1 формирано везикула со посредство. 11 1.1.2.2 Мотиви за препознавање на комплексни протеински адаптери. 13 1.1.2.3 Интеракции на АП-1 со додатоци на протеини. 16 1.1.3 GGA адаптери. 19 1.1.4 Транспорт со посредство на АП-1. 22 1.2 Нок-аут модели на глувчето на АП-1 Адаптин. 25 1.2.1 Фенотип на γ-нокаут глувци. 25 1.2.2 Фенотип на μ1 нокаут глувци. 26 1.2.3 Фенотип на нокаут-глувци σ1b. 26 2. Прашање. 28 3. Материјал и методи. 29 3.1 Често користени решенија и уреди. 29 3.1.1 Бафери. 29 3.1.2 Културни медиуми. 29 3.1.3 Уреди. 30 3.1.4 Центрифуги и ротори. 30 3.2 Молекуларни биолошки методи. 31 3.2.1 Изолација на геномска ДНК од биопсии на опашката. 31 3.2.2 Врнежи на ДНК со етанол. 31 3.2.3 Екстракција на фенол-хлороформ на ДНК. 32 3.2.4 изолација на РНК од ткивата. 32 3.2.5 Квантификација на нуклеински киселини. 33 3.2.6 ПЦР. 33 3.2.6.1 PCR пристап за генотипизирање на глувците σ1b -/- -. 35 3.2.6.2 PCR за генотипизирање на глувци од стапица Gene1. 36 3.2.7 Ограничување на варењето на ДНК. 38 3.2.8 Одвојување на ДНК со гел-електрофореза на агарозни гелови. 38 3.2.9 Екстракција на ДНК од гелови од агароза. 40 3.2.10 Сврзување на ДНК фрагменти. 41
Содржина III 3.5 Протеински биохемиски методи. 58 3.5.1 Екстракција на протеини од целина во клетките. 58 3.5.2 Производство на ткивен хомоген. 58 3.5.3 Определување на протеини според Брадфорд. 59 3.5.4 Електрофореза со гел од полиакриламид (SDS-Page) според Лаемли. 59 3.5.5 Трансфер на протеини во нитроцелулоза (Western blot). 62 3.5.5.1 Полусув размачкан. 63 3.5.5.2 Влажно размачкување. 63 3.5.5.3 Имунобоење на мембрани на нитроцелулоза/PVDF. 64 3.6 други методи. 66 3.6.1 ЕЛИСА за мерење на серумските концентрации на разни адипокини. 66 3.6.2 Анализа на FACS (сортирање на клетки активирани со флуоресценција) на изолирани адипоцити. 67 3.6.3 Боење на адипоцити со масло-црвено О. 67 4. Резултати. 69 4.1 Фенотипизација на сојот на глувците со дефицит на σ1b. 69 4.1.1 Воден биланс на глувците со недостаток на σ1b. 69 4.1.2 Серумска анализа на глувци со недостаток на σ1b. 78 4.1.3 σ1b-зависна функција на масното ткиво. 79 4.1.3.1 Карактеризација на масното ткиво. 80 4.1.3.2 Функционален преглед на масното ткиво. 83 4.1.3.2.1 Толеранција на глукоза кај глувци со недостаток на σ1b. 83 4.1.3.2.2 Концентрации на адипоцитокини во серумот. 85 4.1.2.3.2 Влијание на диета богата со маснотии врз тежината на глувците со недостаток на σ1b. 87 4.1.3.3 Диференцијација на масното ткиво. 90 4.1.4 Бихејвиорални студии на глувци со недостаток на σ1b. 100
Кратенки V Кратенки Å öngström Сл. Слика на огласот се пополнува до крајниот волумен а.д. аква дестилата АДП аденозин дифосфат АП адаптер протеински комплекс АПС амониум персулфат АРФ АДП-рибозилација фактор БФА Брефелдин АБП базен пар БСА говеда серумски албумин Ц степени Целзиусови CCV клатрин обложен везикула ЦДНА комплементарна ДНК Ци Кури (2,22x10 6 броеви во минута) COP деоксиаденозин трифосфат dctp деоксицитидин трифосфат DEPC диетил pyrocarbonate dgtp деоксигванозин трифосфат односно DMEM Dulbecco е модификуван Eagle средни dntp деоксирибонуклеотид DMSO диметилсулфоксид ДНК деоксирибонуклеинска киселина DTT EDTA desoxyribonucleic киселина E. colo-трифосфат Eithiothreitol dttpiphosphate
Кратенки VI EGF епителен фактор на раст ELISA ензим-поврзан имуно-сорбентен тест ЕнТХ епсин N-терминална хомологија ЕР ендоплазматски ретикулум ERGIC ER-Golgi интермедијарен оддел ES ембрионални матични клетки и др. et alii (лат. и други) EtBr етидиум бромид ФАКС сортирање на флуоресценција активирано со флуоресценција FKS фетален телински серум g грам GAE γ-адаптин-уво-хомолог GAP GTPатаза-активирачки протеини GAPDH глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа GGA и TOM1osp БДП гуанозин ГПЦ-нуклеотиден фактор на размена GGA-локализиран со Golgi-локализиран, γ-уво-содржан, ARF-врзувачки протеин GLUT4 транспортер на глукоза 4 ГТП гванозин трифосфат час час H 2 O вода т.е 2 О дестилирана вода HRP рен пероксидаза IgG имуноглобулин Г IP интраперитонеална килограми килограми килобази ко нокаутирам супа од лизогенија L литар LB моларна
Кратенки VII ma milliampere MEF глушец ембрионски фибробласти mg милиграм мин минута ml милилитар mm милиметар mm милимоларен mmhg милиметар жива MOPS 3- (N-морфолино) -пропансулфонска киселина MPR маноза-6-фосфат рецептор mrna гласник nm рибонуклеинска киселина миг нанометар микрометар наг нанометар микрометар наг нанометар микрометар миг милиметар милиметар n-терминален аминотерминален ОД оптичка густина PAA полиакриламид PBS фосфат растворуван солен раствор на PCR полимераза верижна реакција ph негативен декаден логаритам на концентрација на протони PI-3-P фосфатидилиозитол-3-фосфат PI-4-P фосфатидилинизол-4-фосфатифос-4,5PP-4,5, 5-бисфосфат ПЛ плазма мембрана п.к. пикомоларна PP2A протеин фосфатаза 2А PVDF поливинилидин дифлуорид РНК рибонуклеинска киселина РНК-рибонуклеаза РТ собна температура вртежи во минута вртежи во минута види натриум ДДецил сулфат СДС
Кратенки VIII SNARE SSC сек Таб. Taq TE TEMED TGN Tris U ü.n. УВ V види VHS WT w/v v/v xg на пр. „SNAP и NSF рецептори за приврзаност“ стандардна солена вода цитратна втора маса Thermophillus aquaticus Tris/HCl EDTA N, N, N, N единица на ензим на трихидроксиметилатиламинотан во транс-Голги (единица) преку ултравиолетово светло волти во споредба со Vps27p, Hrs и STAM тежина од диви видови Однос на волумен и волумен x поголем од забрзувањето како резултат на гравитацијата, на пример
Вовед 7 е колокализиран (Симпсон и сор., 1997; Педен и сор., 2004). До денес, не е пронајден АП-3 во прочистените CCV од мозочното ткиво (Симпсон и сор., 1996; Dell'Angelica et al., 1997b; Blondeau et al., 2004). Функционалните студии со мутиран мотив за врзување на АП-3 кларин исто така не покажаа никаква интеракција. Сепак, се чини дека популациите поврзани со клатрини, како и без клатрини, постојат во клетката (Педен и сор., 2004). АП-3 врзаните CCV можат да бидат изолирани од човечката, епителна туморска клетка линија HeLa (Борнер и сор., 2007). Затоа може да биде дека врзувањето со кларин-АП-3 е многу кревко или количината на АП-3-врзувачки, клатрински обложени везикули варира во различни типови клетки (ellуел-Литва и сор., 2007). Комплексот АП-4 нема класична клатринска кутија и не е откриена никаква специфична интеракција. Сепак, АП-4 беше откриен во близина на клатрин во електронски микроскопски слики (Бароа и Баке, 2005). Слика 3: Специфични транспортни патишта со кои се посредуваат протеините на адаптерот TGN: Транс-Голги мрежа; б ее: базолатерален ран ендозом; a ee: апикален ран ендозом; Lys: Lysosom, повторно: рециклирање на Endosom за понатамошни објаснувања, видете го текстот (по Schu, 2005).
Вовед 9 има место за врзување, но μ1 под-единица, за разлика од μ2, нема мотив за врзување на фосфатидилинозитол фосфат. Слика 4: Структура и состав на (а) АП-1 и (б) АП-2 Индивидуалните подединици се идентификуваат според соодветните бои како што е прикажано во шемите (б) и (г). Соодветната локација за врзување на YxxΘ е обележана со овално и PI-4-P-место за врзување во AP-1 и PI-4,5-P 2-страницата за врзување окупирана од D-мио-инозитол-хексакисфосфат (IP6) во AP2 од страна на круг. Во споредба со μ2 под-единица, на μ1 под-единица на АП-1 недостасува местото на врзување за фосфатидилинозитол. (Колинс и сор., 2002; Хелдвејн и сор., 2004 година) Јадрото на комплексите на адаптерите се мери приближно 100 Å x 80 Å, а доменот на шарката на двете големи подединици веројатно се протега до 200-300 Å колку што е нема стабилна секундарна структура. Затоа, ушните домени можат да бидат лоцирани далеку од мембрано-врзаното јадро на комплексот и да комуницираат со други протеини во цитоплазмата.
Вовед 10 Слика 5: Шематски приказ на различните изоформи на под-единиците на АП-1. Две изоформи се познати и за γ и μ1. Постојат дури три изоформи опишани за σ. σ1b е откриен во три варијанти на споеви. Изоформите кодирани од повеќе гени се опишани за многу од адаптините кај цицачите. Варијанти на споеви се пронајдени само кај α-адаптин. Во случај на АП-1, се изразува барем една алтернативна изоформа за сите вклучени протеини, освен за β1 под-единицата. Шематска компилација на овие протеини е прикажана на слика 5. Изоформата на γ2 е 60% хомологна со γ1 адаптин. Скратено е во променливиот регион на шарката. За разлика од γ1 под-единицата, не може да се открие никаква интеракција помеѓу γ2 и β-под-единица во хибридниот систем во квасец два. Ова сугерира дека нема in vivo комплекс со γ2. Три гени се познати по σ1-адаптин, σ1a, -B и -C. Тие покажуваат 70-80% идентитет на ниво на протеини (Рил, 2004). Ин витро, σ1a и σ1b се врзуваат за обете изо-форми (γ) (Takatsu et al., 1998; Takatsu et al., 2001). Покрај тоа, во нашата лабораторија беа направени три различни варијанти на споеви
Вовед 15 Општо земено, им претходи неколку кисели остатоци од аминокиселини, овие се нарекуваат и кисели мотиви на дилеуцин во кластери. Во овој случај, аспартатот (Д) не може да се замени. За разлика од сигналите (D, E) xxxL (L, I), DxxLL не се врзува за АП комплекси in vitro, туку за мономерните адаптери од семејството GGA (Puertollano et al., 2001; Zhu et al., 2001) ) (види 1.1.3). Друго семејство на сортирање мотиви се состои од низа аминокиселини кои содржат една до три места на фосфорилација за казеин киназа II (CKII). Овој мотив се наоѓа во многу трансмембрански протеини кои циркулираат помеѓу TGN и ендозомите. Фосфорилацијата со CK-II е главно неопходна за повратен транспорт од ендозомите до TGN. За протеинот PACS1 (протеин за сортирање на кисели кластери на фосфофурин 1) може да се покаже дека ги врзува и фосфорилираните, кисели групи, како и АП-1 и АП-3. Површината за врзување на АП-1 беше идентификувана на μ и σ (Ван и сор., 1998; Крамп и сор., 2001).
Вовед 16 1.1.2.3 Интеракции на АП-1 со дополнителни протеини Слика 6: Мрежата на АП-1 и неговите партнери за интеракција Линиите за поврзување помеѓу одделните протеини симболизираат интеракција. Опишани се дополнителни партнери за интеракција за кои се верува дека генерираат средина специфична за АП-1 CCV. Повеќето од овие додатоци на протеини се врзуваат за ушните домени на големите под-единици на АП-1, при што γ1 интеракциите имаат најголем афинитет. Бидејќи овие домени покажуваат најмала сличност меѓу адаптините, се воспоставуваат многу специфични врски. Слика 6 ги прикажува АП-1 врзувачките протеини и интеракциите помеѓу компонентите се симболизирани со линии. За сите овие протеини не може детално да се дискутира подолу, па затоа ќе се ограничам на оние за кои има најмногу информации. Функциите на повеќето од овие протеини се непознати и важноста на врзувањето за АП-1 е испитана само за неколкумина. Последната група вклучува ARF1GAP, кој е потребен за растворање на протеинскиот коверт. Можете исто така да користите Rabaptin5
Вовед Предизвикани се 19 остатоци низводно од идентификуваните мотиви, WVQF и WGDF, од овие придружни протеини (Mattera et al., 2004). 1.1.3 ГГА адаптери Мономерните ГГА протеини (локализирани во Голги, содржани γ-уши, аРФ-врзувачки протеини) придонесуваат за формирање на протеини обложени со кларин на TGN. Протеините GGA беа идентификувани во базите на податоци врз основа на хомологијата на една од нивните домени во доменот на увото на γ-адаптин и беа испитани во однос на нивната улога во сортирањето на процесите на TGN (Bonifacino, 2004) Тие се наоѓаат и на ендозомите. Три гени кои кодираат GGA1, GGA2 и GGA3 се опишани кај цицачите. Семејството е конзервирано во еукариоти, а квасецот има и два протеини ГГА. Протеините GGA имаат модуларна структура (види слика 7). Неговите три преклопени домени се поврзани со неструктурирани низи. Слика 7: Модел на структурата на GGA1 Структурите на одделните домени беа комбинирани тука за да формираат модел и на одделните домени им беа доделени нивните партнери за врзување. Изменето од (Гош и Корнфелд, 2004)