Аеробна биогенеза на сеноумски наночестички од ентеробактер клоака z0206 како резултат на

предмети

апстрактен

Во оваа студија, ја испитавме способноста на Enterobacter cloacae Z0206 да го намали токсичниот натриум селенит и механизмот на овој процес. Откриено е дека E. клоака Z0206 целосно го намалува селенитот до 10 mM на елементарен селен (Se °) и формира наночестички на селен (SeNP) под аеробни услови. Ефекторот на намалување на селенитот на клетката E. cloacae Z0206 треба да биде ензим локализиран во мембрана. Анализата на протеомот iTRAQ покажа дека селенитот предизвика значително зголемување на експресијата на фумарат редуктаза. Покрај тоа, и додавањето фумарат во чорбата и исклучувањето на фумарат редуктазата (frd) значително ја намалија стапката на намалување на селенитот, откривајќи ја претходно непрепознаената улога на E. cloacae Z0206 фумарат редуктаза во намалувањето на селенитот. Спротивно на тоа, одговорите со глутатион-тип на сликар не беа примарен пат до намалување на селенитот. Сумирајќи, E. cloacae Z0206 ефикасно го намали селенитот на Se ° со употреба на фумарат редуктаза и формираше SeNP; Оваа способност може да се искористи за развој на биореактор за третман на нечистотии на Se и за биосинтеза на SeNP во иднина.

вовед

Се покажа дека намалувањето на селенитот во Se ° е со посредство на тиолите (живописни реакции) во цитоплазмата како дел од стратегијата за микробна детоксикација 29. Селенитот реагира со GSH и формира селенодиглутатион (GS-Se-SG), кој дополнително се намалува на глутатион селеноперсулфид (GS-Se -) со NADPH-глутатион редуктаза. GS-Se - е нестабилен среден медиум и се подложува на реакција на хидролиза за да се формира Se ° и намалена GSH. Покрај живописните одговори, пријавено е дека голем број терминални редуктази за анаеробно дишење, две нитритни редуктази, индуктивна сулфитна редуктаза и фумарат редуктаза се способни да го намалат селенитот во клетките 30, 31, 32 33 .

Ентеробактер клоака СЛД1а-1, факултативна анаероба со дишење на селен, се покажа како катализатор на намалувањето на селенот и селенитот на Se ° 12, 34, 35 1, 5 mM). Се покажа дека намалувањето на селенот е со посредство на мембрана врзан молибдоензим 36, 37, но механизмот за намалување на селенит во овој сој не е расветлен. Покрај тоа, сите тестови за намалување на селенит, вклучени во E. клоаки, биле извршени во анаеробно опкружување, а способноста за намалување на селенитот на E. cloacae сè уште не е тестирана под аеробни услови. Откриено е дека E. клоака Z0206, сој што го изолиравме од „месо“ од печурката Реиши (Ganoderma lucidum) 38, има одлична отпорност на селенит и толерира повеќе од 100 мм селенит. Во оваа студија ја испитавме (i) способноста на E. cloacae Z0206 да го намали селенитот под аеробни услови, (ii) својствата и локацијата на произведените SeNP и (iii) механизмот на намалување на селенитот во сојот Z0206.

Резултати и дискусија

Профил на раст и способност за намалување на селенитот на E. cloacae Z0206 во различни концентрации на селенит

Намалување на растот и селенитот на E. cloacae Z0206 во присуство на различни концентрации на селенит. ( А. Очигледни промени во потрошената супа. ( Б. ) Профил на раст во различни концентрации на селенит. Примероци од 1 ml од бактериската култура беа собрани во различни временски интервали на раст на бактериите и потоа беа центрифугирани 10 минути на 4 ° C и 10 000 x g. Протеинот е извлечен од пелетот со помош на тест комплет за тотална екстракција на бактериски протеин. Растот на бактериите се мери со квантифицирање на вкупниот клеточен протеин. Се утврди концентрацијата на протеини во екстрактите од бактериски клетки. ( Ц. ) Количина на бактерии во моментот во моментот 96 ч. ( Д. ) Динамички промени во остатокот од селенит во супа. ( Е. ) Кинетичка истрага за редукција на селенит со E. cloacae Z0206 под различни концентрации на селенит. Линиските графикони и графиконите со графикони се претставени како средни ± SD, ** стр

Карактеризација и локализација на SeNPs синтетизирани од E. cloacae Z0206. ( А. ) СЕМ слика на E. cloacae Z0206 и SeNPs. ( Б. ) EDX анализа на содржината на јаглерод, азот, кислород и селен во опсег од ( А. ) ( Ц. ) Анализа на елементарно мапирање на дистрибуцијата на селен, јаглерод, кислород и азот во опсег од ( А. ) ( Д. ) ТЕМ-слики на E. cloacae Z0206 и SeNPs. ( Е. ) EDX анализа на честичките 1 и 2 во ( Д. ) ( Ф. ) Висока резолуција Se 3D XPS на прочистен SeNPs, синтетизирана од E. cloacae Z0206.

Способност за намалување на селенитот на различни клеточни фракции од клетките на E. cloacae Z0206

Капацитет на намалување на селенитот кај различни фракции на E. cloacae Z0206. Способноста за намалување на селенитот на бактеријата беше проценета со користење на следната мешавина на реакција: 100 µg протеин, 10 mM селенит и 10 mM NADH во 200 µl Tris-HCl (pH 7,5). Реакционата смеса се инкубираше на 37 ° C 8 часа. Реакционата мешавина со целата клеточна фракција и без селенит служеше како позитивна или негативна контрола.

iTRAQ анализа на протеините E. cloacae Z0206 како одговор на селенит

Меѓу идентификуваните протеини, селенитот предизвика 2,42 пати поголемо зголемување на фреквенцијата на фумарат редуктаза (Табела 1). Ли и др. 33 покажа дека намалувањето на селенитот во Shewanella oneidensis MR-1 е со посредство на фумарат редуктаза, што укажува на тоа дека фумарат редуктазата може да игра улога во процесот на редукција на селенит кај E. cloacae Z0206. Сепак, најочекуваните антиоксидантни протеини, како што се глутатион синтетаза, глутатион редуктаза, глутатион дисулфид редуктаза, тиоредоксин, тиоредоксин редуктаза и тиоредоксин-зависен тиол пероксидаза, не покажаа значителна промена како одговор на третманот со селенит (види Табела S2, поддршка на информации).

Анализа на фреквенцијата на mRNA на избраните гени

За да се потврдат резултатите од анализата на iTRAQ, беа проценети фреквенцијата на mRNA на ензимот фумарат редуктаза (frd) и антиоксидантни ензими глутатион синтетаза (gsh A), глутатион редуктаза (gor), тиоредоксин (trx A) и тиоредоксин редуктаза (trx B). Како што е прикажано на слика 4, изразот на mRNA на gsh A, gor, trx A и trx B во клетките по стимулација од селенит не се разликувал од оној пред третманот со селенит. Третманот со селенит, сепак, го промовираше изразот на mRNA на frd на временски зависен начин. Овие податоци потврдија дека E. клоаката може да го намали Z0206 селенитот на Se 0 со фумарат редуктаза наместо реакција со ССС-посредство на GSH.

Влијание на селенит врз транскрипцијата на фумарат редуктаза и ензими вклучени во сликарските реакции. Културата на E. cloacae Z0206 преку ноќ беше прилагодена на OD 600 = 1 и разредена во свежа супа (1%). Кога културата достигна стационарна фаза, земен е примерок од 2 ml од културата (како контрола без Se). Потоа 500 мм Додаден е 1 количина на парчен раствор на натриум селенит (1 М) и културата се инкубира уште 120 минути. Примероците беа собрани 30 минути, 60 минути и 120 минути по додавањето на селенит. * П.

Влијание на БСО врз растот и намалувањето на селенитот кај Е.клоака З0206. ( А. ) Раст на E. клоака Z0206 во присуство на 1,5 мм, 3,0 мм и 5,0 мм БСО. Потоа, клетките се инкубираат во присуство на 5 мл селенит со додавање на 0 мм, 1,5 мм или 3,0 мм БСО. Примероците беа земени во различни периоди за да се утврдат остатоците од селенит, а примероците на клетките беа земени во 24 часа, 48 часа и 72 часа за да се измерат интрацелуларните концентрации на GSH. ( Б. ) Намалување на селенитот во присуство на БСО. Резултатот беше претворен во процент од почетната концентрација на селенит. ( Ц. ) Ефект на BSO врз интрацелуларните концентрации на GSH. * П 33 постоеше и фумаратната редуктаза може да биде главната патека на редукција на селенит во E. клоака Z0206.

Методи

Бактериски сој Z0206 и услови на култура

E. клоака Z0206, сој што претходно го изолиравме 38, беше во оптимизирана супа (сахароза 25, триптон 5, екстракт од квасец 5, K 2 HPO 4 · 3H 2 O 2, 62, KH 2 PO 4 1, MgSO 4 0,5 ин) култивирани g L-1) на 32 ° C и 250 вртежи во минута.

Раст на бактерии под стрес на селенит

Ефектот на селенитот врз растот на E. cloacae Z0206 е утврден во присуство на 0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM и 15 mM натриум селенит. Натриум селенитот беше подготвен како раствор од 1 М и беше стерилизиран со филтрација. Тогаш 500 ml Ерленмајер колби кои содржат 100 ml супа беа дополнети со зголемување на концентрациите на селенит (0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM и 15 mM), а бактериската култура преку ноќ се сведе на 600 OD сет = 0,5 и инокулиран (1% големина на инокулум) на горенаведената супа што содржи различни концентрации на селенит, проследено со инкубација на 32 ° C, 250 вртежи во минута за 96 часа.

Одредување на концентрацијата на селенит

Културата беше собрана и центрифугирана на 10 000 x g за 10 минути. Супернатантот беше собран за откривање на остаток на селенит со флуорометриски метод 2,3-диаминонафталин 41. Дополнителни информации за откривање на селенит може да се најдат во делот 1.2 под „Дополнителни информации“.

Анализа на SEM и EDX

Беа собрани култури на Z0206 во присуство на разни концентрации на селенит (0mM, 0,5mM, 1mM, 5mM, 10mM и 15mM). Овие примероци беа центрифугирани на 4 ° C и 12,000 × g за 15 минути, а потоа пелетите беа измиени (0,1 M PBS), фиксирани, исушени и распрснати обложени, проследено со набудување под SEM. Мапите на составните елементи на избраните области беа анализирани со системот EDX.

Анализа на TEM и EDX

Беа собрани култури на Z0206 одгледувани во присуство на разни концентрации на селенит (0mM, 0,5mM, 1mM, 5mM, 10mM и 15mM). Овие примероци беа центрифугирани 15 минути на 4 ° C и 12,000 × g, а потоа пелетите беа измиени (0,1 M PBS), фиксирани, сушени и вградени. Ултратенките делови од 100 nm беа исечени и обоени, проследено со набудување под TEM. Елементарниот состав на избраните честички беше анализиран со системот EDX.

Погледнете анализа на валентноста на честички

E. клоака Z0206 се одгледуваше во присуство на 5 мл селенит 72 часа на 32 ° C и 250 вртежи во минута. Честичките на селен се добиени од културата според методот опишан од Добијас и сор. Одвоен развиен протокол. 42 со мала промена. Накратко, културата се преточи, проследена со едноставна центрифугација на 4 ° C на 8.000 x g за 10 минути за да се оддели суспендираната биомаса. Собраните честички Se присутни во супертантот од претходниот чекор на центрифугирање беа концентрирани со центрифугирање на 4 ° C и 20,000 x g за 15 минути. Тогаш пелетот беше лиофилизиран и анализиран со употреба на XPS.

Одвојување на клеточните фракции и определување на активноста за намалување на селенит

Културата E. cloacae Z0206 израсната во експоненцијална фаза без селенит беше собрана и центрифугирана 10 минути на 4 ° C и 10 000 x g. Супернатантот потоа се собра и се филтрира со помош на филтер од 0,2 μm. Следно, пелетот се миеше двапати со 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) и се суспендираше во истиот пуфер за сонификација, проследено со центрифугирање на 4 ° C на 6,000 × g за 10 минути за да се одделат нераскинатите клетки. Потоа, супернатантот беше центрифугиран на 4 ° C на 25,000 × g за 40 минути за да се одделат фракциите на цитоплазмата (супернатантот) и мембраната (пелетот). Концентрацијата на протеините се мери со комплет за анализа на BCA.

Анализа на RT-PCR

РНК е извлечена со мини комплет RNeasy Protect Bacteria. Вкупната РНК беше подложена на реакција на обратна транскрипција користејќи комплет за обратна транскрипција Quanti Tect. Квантитативниот PCR се изврши со систем за реално време StepOne Plus PC со користење на FastStart Universal SYBR Green Master (ROX).

Одредување на интрацелуларните концентрации на GSH

Клетките собрани од експериментот за „Ефектот на BSO врз намалувањето на селенитот кај E. cloacae Z0206“ во временските точки 24 часа, 48 часа и 72 часа беа концентрирани со центрифугирање на 10 000 g, 4 ° C за 10 мин. и повторно суспендиран во 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), по што клетките биле нарушени со помош на ултразвук. Нарушените клетки беа центрифугирани на 20 000 x g за 15 минути и супернантите беа собрани за да се утврди концентрацијата на GSH со помош на комплет за анализа на тотален глутатион.

Конструкција на мутанот Δ frd

& Дгр; четвртиот мутант е конструиран како што е соопштено на друго место 43. Накратко, фрагментот на фузијата на frd генот беше засилен и лигиран преку PCR, потоа се лигираше со pLP12 и последователно се трансформираше во Escherichia coli β2163. Резултирачките плазмиди беа воведени во E. cloacae Z0206 со конјугација со E. coli β2163. По два круга на избор, мутантот што го носеше избришаниот frd ген беше потврден со PCR со употреба на прајмери што одговараа на низите пред и по бришењето (видете S4 во дополнителни информации), а потоа секвенционираше.

статистика

Еднонасочна анализа на варијанса (ANOVA) проследена со тест за повеќекратно споредување со ЛСД беше искористена за да се утврди статистичкото значење за повеќе споредби и студентскиот т-тест беше користен за споредби во парови. П.