Бактерицидно дејство на секундарната растителна супстанција изотиоцијанат - ГРИН
Техничка работа (училиште), 2012 година
36 страници, одделение: 1,0
Јоханес Ролер (автор)
Содржина
2. Теоретски основи
2.1 Природна појава на глукозиди
2.2 Важноста на изотиоцијанат за растението
2.3 Основи на хемикалијата
2.3.1 Глукозиди
2.3.2 Синигрин
2.3.3 Изотиоцијанат
2.4 Ензимска конверзија
2.5 Цел на семинарската работа
3. Експериментално спроведување и објаснување
3.1 Користени упатства за тестирање
3.2 Екстракции
3.2.1 Екстракција на синигрин
3.2.2 Екстракција на мирозиназа
3.3 Ензимска хидролиза на екстрактот од глукозид во изотиоцијанат
3,4 тенки слоеви хроматографии
3.4.1 Објаснување на методот на тенок слој хроматографија
3.4.2 Изведување на синигрин тенок слој хроматографија
3.4.3 Спроведување на тенок слој хроматографија на изотиоцијанат
3.4.4 Спроведување на тенок слој хроматографија на изотиоцијанат и синигрин
3,5 ензимски тест
3.5.1 Изведување на тест за ензими
3.5.2 Изведување на тенок слој хроматографија на ензимскиот тест
3.5.3 Објаснување на тестот за ензими
3.6 Методи за откривање на антибактериски средства
3.6.1 Тест за инхибиција за да се демонстрира антибактериското дејство на изотиоцијанат
3.6.2 Биоавтографија
4. Резултати
4.1 Резултати од тенок слој хроматографија
4.1.1 Резултати од тенок слој хроматографија Синигрин
4.1.2 Резултати од тенок слој хроматографија на изотиоцијанат
4.1.3 Резултати од тенок слој хроматографија на изотиоцијанат и синигрин
4.1.4 Резултати од тенок слој хроматографија на тестот на ензимот
4.1.5 Rf вредности за да го претставуваат релативното растојание на трчање во еднонасочна струја
4.2 Резултати од методите за откривање на антибактериски средства
4.2.1 Резултат од тестот за инхибиција
4.2.2 Резултат на биоавтографијата
7. Додаток
7.1 Список на кратенки
7.2 Табели
1. Вовед
2. Теоретски основи
2.1 Природна појава на глукозиди
Глукозидите се формираат од аминокиселини во секундарниот метаболизам на растенијата (Watzl, 2001). Аминокиселините се распаѓаат во алдоксим, кој се декарбоксилира во фенилацетна киселина, а потоа во глукозид (Киндл, 1975). Глукозидите се јавуваат природно само кај растенија од повисок род (Dörnemann, 2008), на пр. Во семејството на крстови (Brassicaceae, синоним. Cruciferae; Ahlheim, 1983) како најважен претставник на родот (Лучијано, 2009). Сепак, глукозидите може да се најдат и во капари (Capparidaceae), настурциум (Tropaeolaceae) и растенија Reseda (Rescedaceae) (Dörnemann, 2008). Во моментов се познати вкупно околу 130 различни глукозиди (Витсток, 2004). Содржината на сува материја во глукозидите може да биде до 1% кај некои видови Брасика (Watzl, 2001), но количината на глукозиди во дива форма може да ја надмине количината содржана во култивирана билка за 1000 пати (Watzl, 2001).
Гликозиди од масло од синап се наоѓаат во растенијата од синап (Синапис), кои исто така припаѓаат на семејството на крстосници (Ахлхајм, 1983; Дернеман, 2008). Сепак, различни видови на сенф формираат мешавина од различни масло од синап глукозиди (Лара-Лелед, 2012). На пример, белиот сенф (Sinapis alba) главно произведува синапин, додека црниот сенф (Brassica nigra) и ориенталниот сенф (Brassica juncea) главно произведуваат синигрин (Lara-Lledó, 2012). Општо, појавата на остар мирис откако ќе се уништи клеточното ткиво на растението, може да укаже на присуство на масло од сенф глукозиди (Dörnemann, 2008). Овој остар мирис е предизвикан од синапни масла (изотиоцијанати), тие произлегуваат од ензимското распаѓање на синапното масло глукозид.
Ензимот што хидролизира масло од синап глукозид се нарекува мирозиназа или β-тиоглукозидаза (Лара-Лелед, 2012; Лучијано, 2009; Вацл, 2001; Дернеман, 2008). Се јавува кај сите растенија кои произведуваат масла од синап.
2.2 Важноста на изотиоцијанат за растението
Производите на ензимско распаѓање на маслото од сенф глукозиди му даваат на растението високо ефективни одбранбени супстанции од предатори (тревојади) и растителни патогени микроорганизми (Витсток, 2004; Аирес, 2009). Овие производи се различни изотиоцијанати (ITC), тиоцијанати и нитрили, кои се исклучително токсични за микробиолошките организми (Лара-Леледо, 2012; Вацл, 2001; Витсток, 2004; Лучијано, 2009). Само изотиоцијанат има бактерицидно, фунгицидно, хербицидно и токсично дејство врз животинското ткиво (Аирес, 2009; Лучијано, 2009; Лара-Леледо, 2012; Хок, 1984).
Оваа форма на самозаштита на растенијата е позната како конститутивна одбрана, бидејќи прелиминарната фаза на одбранбениот агенс веќе била формирана во ќелијата пред контакт со тревојади или патоген. Сепак, растителниот токсин се произведува само кога клеточната структура е директно ранета. Овој процес честопати се нарекува „бомба“ од растително масло од синап затоа што „активира“ само кога двете компоненти ќе дојдат во директен контакт (Витсток, 2004).
Во растението сенф или семе од синап, масло од синап глукозид и мирозиназа се просторно одделени едни од други. Ензимскиот супстрат (масло од синап глукозид) се наоѓа во оддели (вакуоли) во близина на клеточниот wallид (Rausch, 1999), додека ензимот (мирозиназа) е дистрибуиран во таканаречените индобласти (специјализирани клетки/„чудаци“ на клеточната структура) (Сит, 1998) . Ензимот и неговиот супстрат стапуваат во контакт преку механичко дејство, по што започнува реакцијата и одбрамбениот токсин го развива неговиот ефект (Дернеман, 2008; Лара-Леледо, 2012; Вацл, 2001). Сепак, други растителни родови кои содржат глукозиди складираат супстрат и ензим на различни начини. Талевиот крес (Arabidopsis thaliana), на пример, формира таканаречени С-клетки кои содржат глукозид во близина на сито, како и свои клетки на мирозиназата на кората (Витсток, 2004.
2.3 Хемиски принципи
2.3.1 Глукозиди
Глукозидите (глукозинолати) (Слика 1) се хемиски стабилни, ненапарливи, јонски биомолекули кои спаѓаат во групата метаболити кои содржат сулфур. Тие се состојат од единица глукоза на група која содржи сулфур-азот, група на сулфат и варијабилен остаток.Стука, структурата е комбинација на остаток од тиоглукоза на естер на Н-хидроксииминосулфат и остаток на аглукон (R, види подолу). Овој радикал може да се состои од алкил, алкенил, арил или индолил група. Го одредува физиолошкиот ефект (Watzl, 2001; Wittstock, 2004). Има катјонска група на сулфат, обично К + (Дернеман, 2008).
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 1: Општа структура на масло од синап глукозид
Номенклатурата за глукозиди е различна, така што кога ќе се формира заедничкото име, на името на растението му претходи „Глуко“ и се додава крајот „ин“. На пример, глукозидот на крес (Nasturtium officinale) е познат како „Gluco-nasturti-in“ (Dörnemann, 2008). Сепак, систематското име е попрецизно, како што е прикажано на слика 2.
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 2: пример за номенклатура крес
2.3.2 Синигрин
Систематското име на синигрин е алил глукозинолат, хемикалијата е 1- (N- (сулфокси)-
3-бутенимидит-1-тио-β-Д-глукопираноза. Емпириската формула е:
[C10H16NO9S2] −K +. Молекуларната тежина е 397,46 g/mol (Сигма-Олдрич). Слика 3 ја покажува структурата на синигрин.
Слика 3: Молекуларна структура на синигрин
Слика не е вклучена во овој екстракт
2.3.3 Изотиоцијанат
Изотиоцијанатите се сумирани под терминот „масла од синап“. Изотиоцијанатите се испарливи и хемиски нестабилни молекули доколку се формираат од индоил глукозинолати. Тие спонтано се распаѓаат на индол-3-карбинол и други индолни соединенија (Watzl, 2001). Тие произлегуваат од ензимското распаѓање на масло од синап глукозид и имаат токсичен ефект. Основната структура е како што следува (Слика 4):
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 4: Општа молекуларна структура на ITC
Кога се конвертира алил глукозинолат, се формира алил изотиоцијанат (AITC) (Аирес, 2009). Емпириската формула за ова е C4H5NS (структурна формула видете слика 5). Молекуларната маса е 99,15 g/mol (Сигма-Олдрич).
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 5: Молекуларна структура на AITC
2.4 Ензимска конверзија
Хидролизата на маслото од сенф глукозид во масло од синап се катализира од миросиназа, при што се хидролизира сулфур-глукозната врска на подлогата (масло од синап глукозид) (Витсток, 2004). Се формираат еквимоларни количини на β-Д-глукоза, сулфат и специфичен за глукозидот аглукон. Аскорбинската киселина делува тука како коензим, бидејќи може да обезбеди нуклеофилна каталитичка група. Нестабилниот аглукон реагира понатаму на примарниот производ, изотиоцијанат, во зависност од pH вредноста и температурата (Витсток, 2004). Исто така, се формираат секундарни производи како што се тиоцијанати, нитрили и епионионил (Lara-Lledó, 2012). Изотиоцијанатите главно се формираат со неутрална pH вредност, додека нитрилите се формираат со кисела pH вредност (Витсток, 2004). Слика 6 покажува преглед на процесот на ензимска конверзија.
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 6: Механизам и производи на ензимска конверзија на глукозиди
2.5 Цел на семинарската работа
Целта на оваа работа е да се извлечат маслото од синап глукозид синигрин и ензимот мирозиназа од семето на синап. Ензимот треба да го хидролизира глукозидот во изотиоцијанат (ITC). Понатаму, треба да се потврди антибактериското дејство на производот за ензимска реакција и ITC треба да се идентификува во мешавината на супстанцијата на реакцијата.
Целта на оваа работа беше да се утврди за прв пат дали поедноставена верзија на методот на биоавтографија (Reusser, 1967) е погодна за одвојување на изотиоцијанат од реакционата мешавина на процесот на екстракција (тенок слој хроматографија) и идентификување преку токсичен ефект врз бактериите.
Експериментите беа извршени со семе од Brassica juncea, бидејќи, според информациите на Девели ГмбХ, овие содржат повеќе масло од синап глукозид отколку семето на Sinapis alba опишано во упатството за експериментот (Dörnemann, 2008).
3. Експериментално спроведување и објаснување
3.1 Користени упатства за тестирање
Инструкциите за испитување за екстракција на мирозиназа и синигрин, протокол за ензимска конверзија и имплементација на тенок слој хроматографија (TLC), во најголем дел се упатства за курсот: „Секундарни растителни состојки“ од ПД Др. Дитер Дернеман, Филипс-Универзитет Марбург на одделот за биологија (растителна физиологија/фотобиологија) земен (Дернеман, 2008).
Сепак, индивидуалните под-процедури беа променети независно. Сенф од сортата Brassica juncea се користеше за извлекување синигрин и мирозиназа, бидејќи оваа сорта има најголема содржина на синигрин и, според литературата, покажува најсилен антибактериски ефект (Lara-Lledó, 2012).
Инструкциите за тестот за инхибиција на бактериите се земени од книгата "Mikrobiologisches Praktikum" (Друс, 1983). Методот на биоавтографија е изменет од: „Метод за биоавтографија на тенок слој хроматограми“ (Ројсер, 1967).
3.2 Екстракции
3.2.1 Екстракција на синигрин
Процесот за прочистување на синигрин започна со мелење на 10 g семе од синап во малтер со додавање на 30 ml 80% етанол (aq.). Ова ја уништи структурата на клетките и го ослободи глукозидот. Алкохолот спречи ензимска конверзија на синигрин од страна на мирозиназа. Хомогената маса потоа се префрли во колба со еден врат и се дополнува до 100 ml со 80% етанол (толку.). Производот потоа се вареше 60 минути користејќи рефлуксен кондензатор (Слика 7), загревајќи се во водена бања и точката на вриење е приближно 85 ° C како резултат на мешавина од етанол/вода.
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 7: Екстракција на синигрин на слика 8: Колба од
Водена бања со рефлуксен кондензатор 1. Екстракција на синигрин
Како резултат, синигринот беше врзан во етанол-вода фаза на смесата. Потоа, добиениот воден етанол супернантен материјал беше отстранет (1-ва екстракција, слика 8). Користејќи го овој метод, остатокот повторно се меша со 50 ml 80% етанол (толку.) И овој пат се вареше само 30 минути со помош на рефлуксен кондензатор. Оваа втора екстракција треба да го зголеми приносот на сиггрин. Супернантите од двете екстракции беа комбинирани и центрифугирани за целосно одвојување на цврстите материи, а супернантот се отстранува повторно за понатамошна обработка. Во ротирачки испарувач (слики 9 и 10), целиот етанол потоа се вадеше под вакуум и синигринот беше концентриран во водената фаза (Слика 11).
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 10: Пред концентрација
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 9: Ротационен испарувач Слика 11: После концентрацијата
Последователно, смесата прво се дополнува до 10 ml со H2O (dd.), Со силен бело-жолтеникав талог. Потоа се надополнува до 30 ml со H2O (ден.). Потоа се екстрахираше неколку пати со диетил етер, како резултат на што хидрофобните компоненти (на пр. Клеточните липиди) поминаа во етерската фаза и беа извадени од екстрактот со подигнување и повторна употреба на долната фаза. Горенаведениот бел талог може да се отстрани со екстракција на етер. Водената фаза што содржи синигрин беше концентрирана на 5 ml во ротационен испарувач со цел да се концентрира синигрин. Несакан ефект од испарувањето е целосно отстранување на преостанатиот диетил етер. Добиениот препарат беше поделен на делови од 4 × 200 μl и замрзнат на -20 ° C или подложен на тенок слој хроматографија и ензимска конверзија.
3.2.2 Екстракција на мирозиназа
Со цел да се инхибираат клеточните протеази кои можат да го распаѓаат ензимот што треба да се извлече мирозиназа, сите чекори на прочистување се извршени на ладен начин, така што малтерот, толчникот и прибор за јадење се ладат со N2 (ликвидација) пред експериментот. Сега 20 гр семе од синап (Слика 12) се мелеа, ослободувајќи го ензимот од клетките.
Слика не е вклучена во овој екстракт
Слика 12: Контраплан Слика 13: Декантирање Слика 14: Цевка за дијализа
3.3 Ензимска хидролиза на екстрактот од глукозид во изотиоцијанат
Наслов Бактерицидно дејство на секундарната растителна супстанција изотиоцијанат (масло од синап) Одделение 1.0 Автор Јоханес Ролер (Автор) Година 2012 Страници 36 Број на каталог V300661 ISBN (еКнига) 9783656966845 ISBN (книга) 9783656966852 Големина на датотека 1824 KB Јазик Германски белешки Прва награда на 10-та студентска конференција на Техничката конференција на студенти Универзитет во Минхен, соработка со Хелмхолц Центар Минхен, поддржана од Девели ГмбХ. Клучни зборови Гимназиска графика, Технички универзитет во Минхен, Хелмхолц Зентрум Минхен, студентска конференција ТУМ, сенф, масло од синап глукозид, изотиоцијанат, биоавтографија, мирозиназа, бактерицидно дејство, синапис јунис, тенок слој хроматографија, тест за бактериска инхибиција, хемија, биохемија, книга за семинар (еКнига) 12,99 € работа повикувајќи се на Јоханес Ролер (автор), 2012 година, бактерицидно дејство на секундарната растителна супстанција изотиоцијанат (масло од синап), Минхен, ГРИН Верлаг, https://www.grin.com/document/300661
- Сè уште нема коментари.