Дисертација. за стекнување со академска диплома. Д-р медицински на медицинскиот факултет. на Универзитетот во Лајпциг
1 Инженеринг на ткива на тродимензионално срцево ткиво со употреба на мезенхимални матични клетки и хистолошки преглед на ткивото за интеграција и клеточна диференцијација во in vivo модел на стаорец Дисертација за добивање на академска диплома Др. медицински на Медицинскиот факултет на Универзитетот во Лајпциг Поднесено од: Кетлин Спат Датум на раѓање, место на раѓање:, Лош Франкенхаузен Завршено на: Центар за срце Лајпциг Надзор: проф. д-р. медицински Резолуција на Стефан Деин за доделување на докторска диплома од:
2 Содржина Библиографски опис Список на кратенки v vi 1 Вовед Позадина Алтернативни типови на клетки за инженерство на срцево ткиво Карактеризација на МСЦ Пластичност на МСЦ Употреба на МСЦ во срцева регенеративна медицина Двојна улога на МСЦ во развој на тумор Прашања и цели Материјали Уреди и помагала Лабораториски прибор Хемикалии и биохемикалии Лекови и лекови Хемикалии за експерименти врз животни Лабораториски животни Клетки Информации за производителот: cmscs Хемикалии за хистологија Примарни антитела Секундарни антитела Означени антитела за FACS Состав на медиуми Општи раствори за методи за хистологија Методи Користени линии за MSC Изолација на мезенхимални матични клетки од возрасна коскена срцевина на стаорец (smsc) Анестезија на изолација на стаорци Одмрзнување и одгледување на cmscs Субкултура на двете MSC линии Карактеристика на MSCs Цитометриски мерења на проток на Подготовка на MSC на примероците Мерење на примероците на цитометарот на проток ii
4 Содржина 5 Дискусија 71 6 Резиме 80 Список на слики 82 Список на табели 84 Библиографија 85 Додатоци 99 Декларација за независност 102 Виографија 103 Публикации 104 Благодарници 106 iv
6 Список на кратенки AEC AK Aqua dest. BSA BMCs BM-MSC BMMNCs CaCl 2 2 H 2 O CEE CD CH 2 O cmsc cmsc-et CSC 3-Amino-9-Ethylcarbazole Антитела Дестилирана вода Крвни клетки на коскена срцевина од алгимин во серум (нефракционирани клетки на коскена срцевина) мезенхимални матични клетки добиени од мононуклеарни матични клетки на коскена срцевина клетки (мононуклеарни клетки на коскена срцевина) екстракт од ембрион од калциум хлорид дихидрат, ембрион, екстракт од диференцијација, формалдехид, комерцијално стекнат мезенхимални матични клетки од коскена срцевина на стаорец, Инженерно ткиво од срцеви матични клетки од cmsc Cx40 Коннексин 40 Cx43 Конексин 43 Cx45 Конексин 45 DAPI DMSO ETA EGM FKS FSC GJIC HCl HE 4,6-диамино-2-фенилиндол диметил сулфоксид етилендиамин тетраацетат ендотелијален фактор на раст Инженерно срцево ткиво Екстрацелуларна матрица флуоресценција активирано скенирање на клетки (проток цитометар) -Eosin vi
7 Список на кратенки IPS клетки индуцирани плурипотентни матични клетки HPF поле со голема моќност (1 HPF = 0,1734 mm 2) HS IgG KCl Kg KG KH 2 PO 4 коњски серум имуноглобулин G калиум хлорид килограм телесна тежина калиум дихидроген фосфат Klf4 Kruppel-како фактор 4 MgCl 2 6 H 2 О MSC MSC-ET NaCl NaH 2 PO 4 2 H 2 O NaOH Na 2 HPO 4 2 H 2 O магнезиум хлорид хексахидрат мезенхимални матични клетки Инженерно ткиво од мезенхимални матични клетки Натриум хлорид Натриум дихидроген фосфат Натриум хидроксид динатриум хидроген фосфат октомври 4 окстамер и пеницилин/стрептомицин фосфат пуфер солена температура собна температура стандардна грешка на просечната самоизолирана мезенхимална матични клетки од коскената срцевина на стаорец Инженерно ткиво од smsc Sox-2 поодредувачки полов регион Y (SRY) -бокс 2 SSC TBS TGFβ TRIS TRITC вртежи во миг VEGF vwf страна растера трис пуфер солен трансформатор на фактор на раст бета Трис (хидроксиметил) -аминометан Тетраметил Родамин Исо-Тиоцијанат У револуции во минута васкуларен ендотелијален фактор на раст Вон Вилебранд фактор vii
16 2 Материјали 2.1 Уреди и помагала Уреди/помагала Тип Производител Земја/град Уред за вшмукување Клеточна култура/микробиологија НеоЛаб Хајделберг ДЕ/Хајделберг Автоклав Вариоклав 75Т HP Медизинтехник ГмбХ ДЕ/Обершлеихајм Абдоминална крпа за смрдисани NOBA Verbandmittel Danz GmbH & Co. KG Ventilator Corporation Инкубатор за врвни филтри Хируршки скалпели за еднократна употреба Nalgene FastCap филтер-единица за филтрирање шишиња од типот BB 16 & 16CU Sigma Aldrich und Chemie GmbH Heraeus Instruments GmbH DE/Wetter US/Hialeah DE/Steinheim DE/Gera BB513, BB511 Aesculap DE/Tuttlinge NO 7/Tuttlinge Егерсунд машина за вградување еднократна хируршка завеса ткиво Tek Vip E150/E cm Rancodrope Sakura Finetek Europe BV Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG NL/Alphen aan den Rijn DE/Neuwied за еднократна употреба жилети Med Compfort AMPri GmbH DE/Stelle Eismaschine 2BE Ziegra-Eismaschinen DE/Isernhagen Електричен цитометар за проток на електрична стимулација (FACS) произведен во домот Leipz Ligig медицинска технологија II BD DE/Хајделберг Фаден свилена плетенка SMI BE/St. Микробаланс на балансот Sartorius BP210D DE/Göttingen PowerShot G5 Canon GB/Middlesex мерач на проток на гас M-45 Stöckert Instrumente DE/Минхен 9
19 2 Материјали Уреди/Тип на помагала Производител Земја/Град Топлинска бања Хистологија Тип 24900 Medax Nagel GmbH DE/Kiel Heat Cabinet M400 Memmert GmbH & Co. KG DE/Schwabach Q-Gard2 EMD Millipore Corporation US/Billerica Cell Culture Bank Type HS12 Heraeus Instruments GmbH DE/Gera Megafuge 1.0 R Heraeus Instruments GmbH DE/Gera Табела 2.1: Уреди и ресурси. 2.2 Лабораториски прибор Лабораториски прибор Тип Производител Земја/Град Лента за автоклав Steri Clin VP-Group DE/Feuchtwangen Покривни очила mm, mm Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Карлсруе EHT калап самопроизведен Glasbläserei Kind DE/Лајпциг Вметнат калап ткиво Tek III Sakura Finetek Europe B. Вметнување касети K115.1 Carl Roth GmbH & Co. KG Епендорф цевки 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Greiner-Bio-One GmbH NL/Alphen aan den Rijn DE/Карлсруе DE/Frickenhausen Erlenmeyer колба 2 l Simax US/Систем за третман на вода Elk Grove Village FACS - кружни долни цевки/BD DE/Хајделберг FACS Flow 20 l, BD DE/Heidelberg Falcontubes 15 ml, 50 ml Greiner Bio-One GmbH DE/Frickenhausen Fettstick Dako Pen Dako GmbH DE/Хамбург влажна комора Волфганг Векерт Филтер Китцинген 100 μm 2 BD DE/Хајделберг филтер-хартиени стаклени шишиња Tissue Tek II SA ml, 500 ml, 1000 ml Vogel GmbH & Co. KG Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Gießen DE/Карлсруе 12
21 2 Материјали Лабораториски прибор Тип Производител Земја/град Совети за серолошка пипета Шприцеви Садови за мерење 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml 2 ml, 5 ml, 100 ml, 25 ml mm, mm TPP BD Carl Roth GmbH & Co. KG Колби за култури на клетки 75 см 2 Greiner Bio-One GmbH US/St. Луис ДЕ/Хајделберг ДЕ/Карлсруе ДЕ/Фрикенхаузен Табела 2.2: Лабораториски прибор. 2.3 Хемикалии и биохемикалии Општи хемикалии Тип Производител Земја/град Етанол денатуриран, 99,8% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe HCl 37% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Isopropanol Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Карлсруе КЦЛ Мерк КГаА ДЕ/Дармштад NaCl> 99,5% Карл Рот ГмбХ & Ког КГ ДЕ/Карлсруе НаОХ> 99% Карл Рот ГмбХ & Ко КГ ДЕ/Карлсруе метанол> 99% Карл Рот ГмбХ и Ког КГ ДЕ/Карлсруе ТРИС> 99% Карл Рот ГмбХ & Ко КГ ДЕ/Карлсруе Табела 2.3: Општи хемикалии. Хемикалии за клеточна култура Тип Производител Земја/Град Аква дест. BSA Glukose Monohydrate D + Milli Q Academic System Millipore GmbH Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Schwalbach DE/Steinheim for Microbiology Merck KGaA DE/Darmstadt CaCl 2 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Карлсруе 14
22 2 Материјали Хемикалии за клеточна култура Тип Производител Земја/Град ХЕПЕС> 99,5% Сигма Олдрич и Чеми ГмбХ ДЕ/Штајнхајм КХ 2 ПО 4> 99,5% Карл Рот ГмбХ и Ког КГ ДЕ/Карлсруе MgCl 2 6 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Карлсруе Na 2 HPO 4 2 H 2 O Merck KGaA DE/Darmstadt NaH 2 PO 4 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Карлсруе силиконско лепило Dow Corning 734 Dow Corning Corporation US/Мидленд силиконски лепило стерилен Medtronic World САД/Минеаполис Трипан Блу 0,4% Life Technologies GmbH/Gibco DE/Darmstadt Табела 2.4: Хемикалии за клеточна култура. Медиуми за култура и компоненти на ЕХТ Тип Производител Земја/Град Адипогенизис Диференцирачки комплет Пилешки ембрионски екстракт Матригел (вонклеточна матрица) Серум за фетални телиња (FCS) A Thermo Fisher Scientific DE/Дармштат замрзнат CE-650-J Sera Laboratories International BD, Merck KGaA/Biochrom GB/Какфилд ДЕ/Хајделберг ДЕ/Берлински коњски серум Термо Фишер Научен ДЕ/Дармштат Колаген Опашка од стаорец Сигма Олдрич и Шеми ГмбХ ДЕ/Штајнхајм Колагеназа Тип II Мерк KGaA/Биохром ДЕ/Берлин М199 Двојно термо Фишер Научен Дермштат M199 Двократно термо Фишер научно ДЕ/Дармштад пеницилин/стрептомицин 5000 IU/ml пеницилин, 5000 μg/ml стрептомицин Термо Фишер Научен ДЕ/Дармштад Табела 2.5: Културни медиуми и компоненти на ЕХТ. 15-ти