Експериментален пристап кон испитување на сигнализацијата со лептин кај каротидните тела и неговите ефекти врз контролата
Резиме
Нашата студија се фокусира на ефектите од сигнализацијата на лептин во каротидното тело (ЦБ) врз реакцијата на хипоксична вентилација (ХВР). Извршивме експерименти со „губење на функцијата“ за да го измериме ефектот на лептин врз ХВР по денервација на ЦБ и „стекнување функција“ за да измериме ХВР по прекумерна експресија на рецепторот на лептин во ЦБ.
Апстракт
Хормон направен со адипоцити, лептин, е моќен стимуланс за здив што може да игра важна улога во одбраната на респираторната функција при дебелината. Каротидните тела (КБ), клучен орган на периферна хипоксична чувствителност, ја изразуваат долгата функционална изоформа на рецепторот на лептин (LepR b), но улогата на сигнализацијата на лептин во контролирањето на дишењето не е целосно разбрана. Ние испитавме одговор на хипоксична вентилација (HVR) (1) кај глувци C57BL/6J пред и по почетната инфузија на лептин и по денервацијата на ЦБ; (2) кај недостаток на LepR b, глувци со прекумерна тежина db/db на почетокот и по прекумерна експресија на LepR b кај КБ. Кај C57BL/6J глувците, зголемениот лептин HVR и ефектот на лептин врз HVR беа укинати со CB денервација. Кај глувците db/db, изразот на lepR b во CB го продолжи HVR. Оттука, заклучуваме дека лептинот во ЦБ работи на подобрување на одговорите на хипоксија.
Вовед
Адипоцит произведува хормон лептин кој делува во хипоталамусот за да се потисне внесувањето храна и да се зголеми стапката на метаболизам. Студиите во нашата лабораторија 1, 2 и други истражувачи 3, 4 покажаа дека лептинот го зголемува хиперкапничниот респираторен одговор (ХВР), хиповентилацијата на дебелината кај лептинот спречува недостаток на дебелина. Сепак, мнозинството дебели лица имаат високо ниво на пластичен лептин и покажуваат отпорност на метаболичките и респираторните ефекти на хормонот 5, 6, 7, 8. Отпорот на лептин е мултифакториелен, но важната улога игра ограничената пропустливост на крвно-мозочната бариера (BBB) на лептин. Предлагаме под BBB лептин да делува во клучен орган на периферна хипоксична чувствителност, каротидно тело (ЦБ), за да се одбрани дишењето кај дебели лица. ЦБ ја изразуваат долгата функционална изоформа на рецепторот на лептин, LepR b, но улогата на КБ во повеќе ефекти на лептин што може да се дише не е соодветно разјаснета 9, 10 .
Целта на нашиот метод беше да се испита влијанието на сигнализацијата на лептин во КБ врз ХВР. Нашето образложение беше да (а) извршиме исклучоци на шпекулации од експерименти со функции кај глувци со непроменети каротидни тела и денервирани каротидни тела, проследено со HVR мерења; б) Зајакнување на функционалните експерименти врз глувци db/db без LepR b, во кои го измеривме HVR на почетокот и по изразот на LepR b исклучиво во CB. Придобивката од нашите техники беше што ги изведовме сите наши експерименти врз неограничени, неестетизирани глувци за време на спиењето и будењето. Претходните истражувачи или ги спроведувале своите експерименти под анестезија 9 или не ги мереле ефектите на лептин за време на спиењето 10. Покрај тоа, нашата студија е прва што користи уникатен пристап на добивка на функцијата со селективен израз на LepR-b во КБ опишан погоре.
Во широк контекст, нашиот пристап може да се генерализира на другите рецептори изразени во ЦБ и нивната улога во хипоксичната чувствителност. Инспекторите можат да инјектираат лиганд на рецептор од интерес и да измерат HVR на почетокот и по денервацијата на CB. Како комплементарен пристап, рецепторот од интерес може да биде преизразен во мерењата на ЦБ и мерењата на HVR може да се извршат пред и по прекумерното изразување со нашата технологија опишана во овој ракопис.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Протокол
Сите експериментални протоколи беа одобрени од Комитетот за грижа и употреба на институционални животни (MO18M211).
ЗАБЕЛЕШКА: За да го проучиме ефектот на лептин врз дишењето, ние инфузиравме лептин субкутано во чисти глувци C57BL/6J преку осмотска пумпа за да ги зголемиме циркулирачките нивоа на лептин кај оние што се гледаат кај глувци со прекумерна тежина.
- Подготовка на осмотска пумпа
- Измерете ја празната пумпа за да ја проверите нето-тежината на натоварениот раствор.
- Додадете лептин (5 mg/ml) во осмотската пумпа (1 L/h за 3 дена). Наполнете ја пумпата со мал шприц (1 ml). По полнењето, затворете ја пумпата користејќи ја предвидената цевка за полнење наклонета со задник со 27 патеки.
ЗАБЕЛЕШКА: Шприцот и прицврстената цевка треба да бидат без воздушни меури. - По полнењето, измерете ја пумпата повторно за да ја проверите нето-тежината на растворот.
- Вметнете ја лептинската пумпа поткожно во меѓу капсуларната област.
ЗАБЕЛЕШКА: Ако сакате веднаш да ја започнете инфузијата, инкубирајте ја наполнетата пумпа на 37 ° C на 37 ° C најмалку 4 до 6 часа (по можност преку ноќ).
2. Хипоксичен вентилациски одговор (ХВР)
3. Денерирање на каротидно тело или дисекција на нерв на каротиден синус (CSND)
ЗАБЕЛЕШКА: Извршивме комбинирана хируршка и хемиска денервација, освен една недела, бидејќи само хируршката денервација не го укинува хипоксичниот хеморефлекс.
4. Изразување на LepR b во CB со аденовирусен вектор (Ad-LepR b) наспроти Control (Ad-LacZ)
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
Континуирана инфузија на лептин значително го зголеми HVR кај слабите глувци C57BL/6J од 0,23 на 0,31 ml/min/g/FiO2 (P Слика 2) 11 CSND го укина зголемувањето на HVR предизвикано од лептин (Слика 2)), додека не беа забележани никакви ублажувачки ефекти на CSND врз ХВР кај лажната хируршка група по инфузија на лептин.
Изразот на LepR b во CB на LepR b - дефицитарни дебели глувци db/db предизвикани значително зголемување на HVR од 0,05 на 0,06 ml/min/g/SpO2 (Слика 3) ХВР не се промени кај животните трансфектирани во ЦБ со контролата Ad-LacZ.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Дискусија
Фокусот на нашата студија беше да се истражат повеќе дишечките ефекти на сигнализацијата на лептин во КБ. Развиени се неколку протоколи за проценка на улогата на лептин на механистички начин. Прво, се анализираше специфичниот придонес на ЦБ во МХП со внимателно квантифицирање на МХП во текот на првите 2 мин на изложеност на хипоксија. Второ, релевантноста на ЦБ со лептин-посредуваната регулација на респираторната контрола беше испитана со два комплементарни пристапа. Кај слаби глувци од див тип со ниско ниво на лептин, HVR беше измерена на почетокот и по континуирана инфузија на лептин; експериментот се повтори по денервацијата на ЦБ Кај глувците со дефицит на LepR b, db/db, HVR беше измерен на почетокот и по изразот на LepR b во CB.
CSND кај глувците е технички баран поради малата големина на животните и нивните КБ. Развивме постојан успешен пристап со стапка на преживување од скоро 100% во строга согласност со нашиот протокол. Контролираните состојби во нашиот протокол вклучуваат термо-неутрална средина, внимателно контролирана анестезија и стандардни стерилни микрохируршки техники со визуелизација на глософарингеалниот нерв како будно постоперативно управување со контрола на болката. Нашето искуство покажува дека само хируршката денервација не го укинува хипоксичниот хеморефлекс. Вториот чекор, хемиска денервација, е проследен со внимателно постоперативно управување за да се подобри преживувањето.
Нашата најиновативна техника е прекумерна експресија на селективни гени во областа на КБ. Овој пристап сè уште не е имплементиран бидејќи КБ се само мали по големина и не се изразуваат специфични двигатели што овозможуваат да се изрази ген од интерес за одреден тип на клетка. Всушност, ЦБ клетките од типот I се многу слични на симпатичните неврони или клетките на надбубрежната медула, додека клетките од типот II се слични на астроцитите 20, 21. Ние ги искористивме глувците db/db на кои им недостасува генот LepR b, нашата способност да се примени аденовирусна суспензија скоро исклучиво на областа CB и својствата на матрицата Matrigel, која брзо се зацврстува на 37 ° C. Нашиот нов пристап може да се користи во иднина за да се испита улогата на кој било ген што изразува специфични за тирозин хидроксилаза (клетки Тип I) или специфични за GFAP (клетки Тип II) нокаути во ЦБ со глувци од целото тело станува.
Нашите протоколи имаат неколку ограничувања. Прво користевме 3% CO2 за да ја одредиме IHL, и останува прашањето дали делот од IHL навистина може да се припише на хиперкапничниот одговор. За да се справат со ова ограничување, истражувачите можат истовремено да измерат одговори на 3% компензација на СО2 во хипероксичен гас, што би го исклучило ЦБ. Второ, ХВР не може целосно да се елиминира со CSND 22. Овој феномен може да се припише на невропластичност, што е особено изразено кај глувците. Оттука, важно е да се проучи HVR што е можно побрзо по CSND и секогаш да се користи контрола на лажна хирургија. Трето, нашиот пристап до изразување на генот КБ немаше типови клетки и специфичност на органите. Молекуларните техники, со идна употреба на повеќе селективни промотори, можат да помогнат во спротивставување на ова ограничување.
Како заклучок, и покрај ограничувањата опишани погоре, нашите протоколи можат да ја испитаат улогата на одредени гени на ЦБ во физиолошките реакции на хипоксија.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Откривање
Авторите немаат спротивставени интереси или откритија.