Ешерихија коли како пробиотски лек на молекуларни и функционални лекови
Ешерихија коли како пробиотичка активна состојка во фармацевтските производи Молекуларно и функционално карактеризирање на соеви кои го поттикнуваат здравјето РАСПОЛНУВАЕ за стекнување со академска диплома Doctor rerum naturalium (Dr. rer.nat.) На Факултетот за математика и природни науки на Техничкиот универзитет во Дрезден претставено од Дипл. Биол. Анке Зшутиг роден на 11,11 .1980 година во Дрезден, доставено на 27 април 2012 година
Содржина СОДРИНА СОДРИНА СОДРИНА. СПИСОК НА АБРЕВИЈАЦИИ. Е СПИСОК НА СЛИКИ. H ИНДЕКС НА ТАБЕЛИ. Ј 1 ВОВЕД. 1 1.1 Човечката цревна микрофлора. 1 1.1.1 Состав и функција на цревната флора. 1 1.1.2 Улогата на ешерихија коли. 3 1.2 Нарушувања на цревната флора и болести. 4 1.3 Пробиотици. 6 1.3.1 Дефиниција, барања, примери. 6 1.3.2 Ефекти и механизми. 7 1.3.3 Области на примена. 9 1.3.4 Мутафлор и Ешерихија коли Нисл 1917. 10 1.3.5 Пробиотици од Симбиофарм. 10 1.3.5.1 Производите од SymbioPharm. 10 1.3.5.2 Симбиофлор 2 - состав и активни принципи. 11 1.4 Секвенционирање на геномот на E. coli. 12 1.5 Антимикробни пептиди од прокариоти. 13 1.5.1 Дефиниција и класификација на бактериоцините. 13 1.5.2 Микрозин. 1.5.3.3 Области на примена - сегашност и иднина. 18 1.6 Задача и цел. 20 2 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ. 21 2.1 Материјали. 21 2.1.1 Користени хемикалии и потрошни материјали. 21 2.1.2 Користени комплети. 21 2.1.3 Бафери и решенија за акции. 21 2.1.4 Културни медиуми за одгледување бактерии. 22 2.1.5 Антибиотици. 23 2.1.6 Додатоци за клетка култура. 23 А.
Содржина 2.1.7 Бактериски соеви. 24 2.1.8 Плазмиди. 25 2.1.9 Олигонуклеотиди. 26 2.1.10 Ензими. 27 2.1.11 Софтвер. 27 2.2 Методи. 28 2.2.1 Одгледување на прокариотски клетки. 28 2.2.1.1 Одгледување на бактерии. 28 2.2.1.2 Сточарство. 28 2.2.1.3 Криви на раст. 28 2.2.2 Одгледување на еукариотски клетки. 29 2.2.2.1 Култура на клетките. 29 2.2.2.2 Замрзнување и одмрзнување. 29 2.2.3 Експерименти во кокултура со прокариотски и еукариотски клетки. 29 2.2.3.1 Анализа на придржување. 29 2.2.3.2 Анализа на инвазија. 31 2.2.3.3 Конфокална микроскопија. 32 2.2.3.4 Електронска микроскопија. 32 2.2.3.5 Тест за зона на инхибиција. 33 2.2.4 Молекуларни биолошки методи. 33 2.2.4.1 Полимеразна верижна реакција (ПЦР). 33 2.2.4.2 Секвенционирање на кратки ДНК делови. 35 2.2.4.3 Електрофореза со гел од агароза. 36 2.2.4.4 Прочистување на ДНК. 36 2.2.4.4.1 Прочистување на ДНК-фрагменти. 36 2.2.4.4.2 Прочистување со помош на екстракција на гел. 37 2.2.4.4.3 Прочистување на реакциите на секвенционирање. 37 2.2.4.4.4 Алкохолни врнежи. 37 2.2.4.5 Определување на концентрација на ДНК. 38 2.2.4.5.1 Мерење на апсорпција. 38 2.2.4.5.2 Одредување на концентрацијата во гел од агароза. 38 2.2.4.6 Употреба на ограничувачки ендонуклеази. 38 2.2.4.7 Дефосфорилација. 39 2.2.4.8 Лигација. 39 2.2.4.9 Производство на компетентни клетки. 39 2.2.4.10 Електропорација. 40 2.2.4.11 Конјугација. 40 Б.
Содржина 3.2.3.3 Ешерихија коли G3/10 - Откривање на антимикробен пептид. 86 3.2.4 Откривање на Микрозин С во ешерихија коли G3/10. 89 3.2.4.1 Анализа на кодирање на оперон за Микрозин С. 89 3.2.4.2 Имунитет на микрозин P. 90 3.2.4.3 Скрининг за присуство на ген mcss кодирање за микрозин S во Enterobacteriaceae. 92 3.2.4.4 Откривање на бактерицидно дејство на микрозин стр. 92 3.2.4.5 Тест за зона на инхибиција. 94 3.2.4.6 Експерименти со коинфекција со ентерохеморагична E. coli. 95 3.2.4.7 Анализа на структурата и класификацијата на протеините. 99 4 ДИСКУСИЈА. 103 4.1 Symbioflor 2 E. coli - анализа на геном и пробиотици. 103 4.1.1 Геноми на Symbioflor 2 E. coli. 104 4.1.2 Пробиотички ефект на Симбиофлор 2. 105 4.1.3 Безбедност на Симбиофлор 2. 106 4.1.4 Споредба на ешерихија коли Г3/10 со ешерихија коли Нисл 1917. 109 4.2 Антимикробни пептиди во ентеробактериите. 111 4.3 Можни употреби на микрозин стр. 113 4.3.1 Прехранбената индустрија. 113 4.3.2 Mikrozin S - нов антибиотик. 115 4.3.3 EHEC - пример за примена. 116 5 РЕЗИМЕ/РЕЗИМЕ. 119 5.1 Резиме. 119 5.2 Резиме. 120 6 ЛИТЕРАТУРА. 123 7 ПРИЛОГ. 140 ПУБЛИКАЦИИ. 172 ПРИЗНАНИЕ. 174 Д.
Список на кратенки SAP SD SDS Singleton-Gen Sm sp. ssp ST STEC stx SUE T a TBE TE Tet TNF trna U UE UPEC UV V VTEC ZKBS ZO Грими алкална фосфатаза стандардна девијација ген на натриум Додецил Сулфат што е специфичен за геном Видови на стрептомицин Подвид Топлина стабилен токсик Шига токсин кој произведува токсин Е. коли Шига Температура на акумулација на настани Трис-Борат-ЕДТА Трис-ЕДТА Тетрациклин Тумор Некроза Фактор Единици Рибонуклеинска киселина Несакани настани Уропатогени E. coli Ултравиолетово Волт производство на Веротоксин E. coli Централна комисија за биосигурност Zonula occludens G
Список на слики Слика 3.31: Скрининг за генот на микрозин H47 mchb во различни соеви на EHEC. 99 Слика 3.32: Аминокиселинска секвенца на протеинот претходник на Микрозин С. 99 Слика 3.33: Споредба на аминокиселинските низи на претходниците на протеините од микрозин од класа IIа. 101 Слика 4.1: Споредба на низата во промоторниот регион на хиликадниот оперон на E. coli G1/2 и E. coli CFT073. 108 Слика 4.2: Структурни компоненти на EcN (A) и E. coli G3/10 (B). 110 Слика 7.1: BLASTp анализа на протеините McsA (A) и McsB (B). 164 И.
Вовед 1.5.2 Микрозин Терминот микрозин е воведен во 1976 година (Асенсио и Перез-Дијаз, 1976) за означување на рибозомално синтетизирани антимикробни пептиди со мала молекуларна маса од 5 kda. Пептидната 'рбетот не е изменета. Линеарните полипептиди имаат C-терминален сидерофор како пост-преведувачка модификација (Vassiliadis et al., 2007). Микрозините од класа IIа се типично организирани во четири гени кодирани на големи плазмиди со мал број на копии. Овие вклучуваат микрозини V (MccV, порано ColV), L (MccL) и 24 (Mcc24). Имунитетен протеин е кодиран во непосредна близина на микроцинот. Покрај тоа, се формираат два протеини вклучени во извозот. Транспортните протеини во класата на микрозин се многу хомологни. Самите микрозини имаат карактеристични сигнални пептиди. MccV и MccL формираат дисулфидни мостови. За разлика од сите споменати микрозини досега, микрозините од класа IIб се хромозомски кодирани. Генетската организација е многу сложена. Пробиотичкиот сој E. coli Nissle 1917, кој ги формира микрозините M (MccM) и H47 (MccH47) (Patzer et al., 2003), служи како пример. Регионот за кодирање на микрозин содржи гени 17
Материјали и методи mcss, mcsi, mcsa, mcsb оваа работа paz8 amp R, mcsi, mcsa, mcsb оваа работа paz9 cm R, mcss оваа работа paz10 cm R, ORF1 оваа работа paz11 cm R, ORF2 оваа работа paz12 cm R, скратена mcss оваа работа paz13 Amp R, mcsi this work paz14 Amp R, скратено mcsi this work paz15 Amp R, PBAD, mcss this work pgs1 Amp R, PBAD this work MCS = Повеќето место за клонирање; ori TS = температурно чувствително потекло на репликација; I-SceI = мегануклеаза; FRT = Цел на препознавање флиппаза; FLP = флиппаза; ORF = отворена рамка за читање; PBAD = промотор на активирац на arac; Засилувач = ампицилин; Cm = хлорамфеникол; Кана = канамицин; Тет = тетрациклин. 2.1.9 Олигонуклеотиди Список на олигонуклеотиди користени од Биомерс (Улм) е даден во додатокот во Табела 7.1 и Табела 7.2. 26-ти
Резултати 3 РЕЗУЛТАТИ 3.1 Анализа на геномите на бактериите 3.1.1 Геномот на Escherichia coli G3/10 Секвенционирањето е извршено како што е опишано во делот 2.2.5.1. Геномот на E. coli G3/10 се состои од 4.935.403 бази. Содржината на ГК е 50,88%. Автоматската и рачната прибелешка идентификуваше 4.844 гени, 87 транскрипти од Трна и 22 транскрипти од РРНА. Геномот во кружна форма е прикажан на слика 3.1. За време на прибелешката, на секоја кодирана секвенца (CDS) и беше доделено име, т.н. ознака на локус, име на ген и генски производ со краток опис. Како основа за ова служеа BLASTn и BLASTp анализите и споредбите со записите во релевантните бази на податоци (Altschul et al., 1990) (извори: [5,6]). Рамките за читање се коментираат автоматски и, доколку е потребно, се коригираат рачно (види 2.2.5.3). Почетокот на геномот на E. coli G3/10 беше одреден од генот dnaa. Геномот во моментов се состои од четири големи делови со три празнини на неодредена секвенца кои не можат да се затворат со PCR. Комплетната секвенца на геномот ќе биде слободно достапна во базата на податоци по објавувањето (Зшутиг и сор., Ракопис во подготовка). 51
Резултати Слика 3.1: Кружна претстава на геномот на E. coli G3/10. Надворешниот прстен содржи скалирање во килобази (kbp). Во вториот прстен, гените на насоката напред се прикажани со сина боја. Прстенот 3 ги покажува гените на нуклеарниот геном што го содржи во црно. Прстенот 4 и прстенот 5 соодветно ги покажуваат гените на комплементарната нишка во сина боја со гените на нуклеарниот геном во црно. Двата внатрешни прстени ја покажуваат содржината на GC (прстен 6) и наклонот на GC (прстен 7), што може да се искористи за да се утврди потеклото на репликацијата на орикот и терминалниот терк. Напредната низа и комплементарната жица содржат приближно ист број на гени (прстени 2 и 5). Гените на нуклеарниот геном (прстени 3 и 4) се дистрибуираат преку двете нишки. Некои поголеми области кои не содржат никакви гени на основниот геном одговараат на геномските острови и профагените региони во кои содржината на ГЦ значително се разликува од просечната содржина на ГЦ во геномот (прстен 6). Тие честопати се поврзуваат со трансите. CDS = низа за кодирање. 52
Резултати Е Слика 3.2AE: Циркуларна претстава на геномите на E. coli G1/2 (A), E. coli G4/9 (B), E. coli G5 (C), E. coli G6/7 (D) и E. коли Г8 (Е). Надворешниот прстен содржи скалирање во килобази (kbp). Во вториот прстен, гените на насоката напред се прикажани со сина боја. Прстенот 3 ги покажува гените на нуклеарниот геном што го содржи во црно. Прстенот 4 и прстенот 5 соодветно ги покажуваат гените на комплементарната нишка во сина боја со гените на нуклеарниот геном во црно. Двата внатрешни прстени ја покажуваат содржината на GC (прстен 6) и наклонот на GC (прстен 7), што може да се искористи за да се утврди потеклото на репликацијата на орикот и терминалниот терк. Напредната низа и комплементарната жица содржат приближно ист број на гени (прстени 2 и 5). Гените на нуклеарниот геном (прстени 3 и 4) се дистрибуираат преку двете нишки. Некои поголеми области кои не содржат никакви гени на основниот геном одговараат на геномските острови и профагените региони во кои содржината на ГЦ значително се разликува од просечната содржина на ГЦ во геномот (прстен 6). Тие честопати се поврзуваат со трансите. CDS = низа за кодирање. 56
Резултати геномотипи на E. coli, локализирани од Symbioflor 2. EcN се смета дека е особено прилагодлив поради неговиот натпросечен број на системи за апсорпција на железо (Грозданов и сор., 2004). Геномотипите на E. coli од Symbioflor 2 носат некои системи за навлегување на железо и тие создаваат конкурентни предности. Сепак, во овие E. coli нема повеќе системи за навлегување на железо отколку во другите споредливи соеви на E. coli. 3.1.4 Плазмидите Symbioflor 2 E. coli се диви видови кои носат неколку природни плазмиди. Преглед на сите содржани плазмиди е прикажан на слика 3.6 со помош на слика на гел од агароза. 62 Слика 3.6: Плазмиди во диви типови на Symbioflor 2 E. coli. Нумерирањето одговара на името на плазмидот, на пр. 3 за плазмидниот psym3. * psym1 работи на ниво на геномска ДНК. psym5 и psym6 не се видливи на гелната слика и се претпоставува дека се присутни во многу мал број копии. М = стандард за големина.
Резултати Структурата на прстенот беше затворена рачно. Тие веројатно ќе бидат во многу низок број на копии. Слика 3.7: Мегаплазмиден psym1 од E. coli G3/10. Должина над 40 kb, плазмидот е 99% идентичен со pmas2027 од уропатогениот E. coli MS2027 (Онг и сор., 2009). Покрај тоа, сепак, е вметната површина од 10 kb (обележана со сина боја), во која е кодирана микрозин S ново идентификувана во ова дело (види 3.2.4). Двата надворешни прстени содржат кодирани секвенци (CDS) на напред и назад насока. Содржината на GC е прикажана во црно во третиот прстен. Прстенот 4 го покажува GC-Skew во зелена (+) и виолетова (-) боја. 64
Резултати ori endo 4000 1800 200 rom/rop 3000 psym2 4197 bps 1000 1400 1600 psym3 1934 bps 400 600 1200 800 2000 1000 csm repa 1200 6000 200 1000 1000 psym4 1304 bps 400 repa 5000 psym5 6567 bps 2000 800 4000 600 3000 ori mobc 10000 4000 8000 psym6 10433 bps 2000 psym7 4452 bps 1000 3000 6000 4000 2000 moba tnpa mobb tnpr mobd Слика 3.8: Плазмидни карти на плазмидите содржани во Symbioflor 2 E. coli со котација на секвенците на кодирање. 65
Резултати ORF-3 12000 2000 2000 ORF-1 ORF-1 1500 psym8 2353 bps 500 ORF-2 ORF-4 ORF-5 10000 8000 psym9 12686 bps 4000 1000 6000 ORF-8 ORF-2 ORF-7 ORF-6 1400 ori 3000 repa 200 500 1200 psym10 1549 bps 400 2500 psym11 3215 bps 1000 1000 600 2000 800 1500 orit ori mobd/mbkd mobb/mbkb 7000 6000 1000 moba/mbka 5000 psym12 7111 bps 2000 csa mobc/mbkc 4000 3000 oriv csl csi Слика 3.8: Плазмидни картички на плазмидите содржани во Symbioflor 2 E. coli со прибелешка за кодирачките низи. (Продолжение). 66
Слика 3.9: Контрола на специфичноста на развиените PCR-специфични видови и групи за E. coli G1/2, G6/7 и G8 (A), E. coli G3/10 (B), E. coli G4/9 (C) и E. coli G5 (D). Резултирачките ленти се врамени со црвена боја. Броевите (#) се однесуваат на главната колекција на работната група Гунцер. М = стандард за големина, НК = негативна контрола.
Табела за резултати 3.5 Преглед на геномите на Symbioflor 2 E. coli (заклучно со јануари 2012 година). Генотип E. coli G1/2 E. coli G3/10 E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G6/7 E. coli G8 Број на плазмиди Проценета должина на хромозомот [bp] 1 Проценета должина на геномот [bp] 1,2 Contig број 1 Проценет број на гени 2 Број на трана 2 4,748,500 4,757,160 36 4,478 82 22 6 4,935,403 5,010,410 4 4,844 87 22 1 4,514,694 4,515,998 29 4,163 72 22 5 4,578,897 4,603,537 43 4,296 84 22 2 4,978,623 4,987,283 41 4,729 81 22 2 4,873,886 4,882,546 62 4.636 73 22 број rrna 1 Вредностите одговараат на контигите доделени до денес. 2 Геномот се состои од хромозом плус плазмиди. E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G3/10 E. coli G6/7 E. coli G8 E. coli G1/2 Слика 3.10: Споредба на геномот на Symbioflor 2 E. coli (заклучно со јануари 2012 година). Филогенетското дрво е генерирано со помош на ЕДГАР (Блом и сор., 2009) и засновано врз основните геноми. 70
Резултати Слика 3.31: Скрининг за микрозин H47 ген mchb во различни EHEC соеви. Различни соеви на EHEC, EcN и E. coli G3/10 беа тестирани со употреба на прајмери mchb_bamhi и mchb_sphi. Генот на микрозин H47 е откриен во соединенијата EHEC DD, FO1 и FO2. PK = позитивна контрола, NK = негативна контрола. 3.2.4.7 Анализа на структурата и класификацијата на протеините Микрозин С (MccS) идентификуван во E. coli G3/10 е 120 АА протеин со пресметана молекуларна тежина од 11,67 kda. Терминот микрозин е воведен за да се однесува на мали антибактериски пептиди со молекуларна тежина