Генерација на химерни глувци со мутации во сигналниот домен на ЦД22 и
Генерација на химерни глувци со мутации во сигналниот домен на ЦД22 и истраги за функцијата на ЦД22 кај нокаут глувци Дисертација за добивање на научен докторат од универзитетот „Баварски Јулиус Максимилијанс“ во Вирцбург претставена од Клаус-Питер Данзер од Манхајм-Некарау Вирцбург, 2002
Поднесено на: Членови на докторски комитет: Претседавач: Рецензент: Др. рер. нат хабил Ларс Ничке рецензент: проф. Д-р. рер. нат Герт Пфлугфелдер Ден на докторски колоквиум: Докторско уверение предадено на:
Објаснување: Со ова изјавувам дека ја извршив дисертацијата за генерирање на химерични глувци со мутации во сигналниот домен на ЦД22 и истраги за функцијата на ЦД22 кај нокаут глувци и дека не сум користел никакви помагала или извори освен оние наведени од мене. Јас исто така изјавувам дека оваа дисертација не е поднесена во ниту една друга постапка за испитување, или во иста или во друга форма. Освен дипломите документирани со апликацијата за прием, претходно не стекнав или не се обидов да стекнам дополнителни академски дипломи. Вирцбург, Клаус-Питер Данзер
Оваа работа беше спроведена од 15 јануари 1998 година до 31 јануари 2002 година на Институтот за вирусологија и имунобиологија на универзитетот „Баварски Јулиус Максимилијанс“ од Вирцбург под надзор на др. рер. нат хабил Ларс Ничке направи.
IV 7.2 Список на публикации. 111 7.2.1 Оригинални тези од оваа докторска теза. 111 7.2.2 Публикации на конгреси/состаноци. 111 8. Додаток. 113 8.1 Кратенки. 113 8.2 Низа на прајмери. 115 8.3 Векторски мапи. 117 9. CV. 120
13 оддел. Затоа, постоеше причина да се сомневаме дека бројот на МЗ Б клетки во ЦД22 -/- глувците може да се намали. Според тоа, треба да се испитаат големината на одделот за М-Б-клетки во глувците ЦД22 -/- и последиците од можното намалување на одговорот на ТИ-2 антигените.: α2,6-сиалинска киселина CD22-ITIM- KO CD22-без опашка Syk SOS? Grb-2 P Y- P Y- P Y- -F ITIM SHC Grb-2 SHIP Lyn PI3K PLCγ2 -F ITIM -F ITIM SH2 SH2 PTPase SHP-1 Слика 3: Два планирани модели на глувци за проучување на сигналната трансдукција на CD22 in vivo . Лева страна: CD22-ITIM-KO: Тирозините во ITIM се мутирани на фенилаланини. Се очекува дека протеинот-тирозин фосфатаза-инхибитор на сигналот SHP-1 повеќе не може да комуницира со CD22 и затоа може да се активира. Спротивно на тоа, с still уште ќе биде можно врзување на позитивните модулатори на сигналот на Б-клетките PLCγ, Lyn, PI3K и Grb-2. Исто така е можно да се поврзе БРОП како дел од комплексот SHIP-Grb2-Shc. Десна страна: CD22-без опашка: Стоп кодон во егзон 12 доведува до изразување на ЦД22 молекула без цитоплазматски домен. Овој модел на глушец ќе го надополни CD22-ITIM-KO. Двата модели исто така ќе послужат за разјаснување на односот помеѓу трансдукцијата на сигналот и функцијата на адхезија на CD22.
14 2.1 Материјали 2. Материјали и методи 2.1.1 E.coliNM522 бактериски соеви: (F`lacIq (lacz) m15 proa + prob + (hsdms-mrcb) 5 (lac-proab) supe thi-1 lambda) првично служеше како клонирачки вид Е. .coliDH5α: F- делта (laczya-argf) u169 phi80delta (lacz) m15 enda1 reca1 hsdr17 deor thi-1 supe44 gyra96 rela1 rpsl lambda- се користеше како стандарден вид на клонирање во подоцнежниот тек на оваа докторска теза E. coliA96: делта (lac-proab) (F trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15) lambdakc (kan-cre) беше искористена за тестирање на функционалноста на loxp секвенците во употребените конструкции за таргетирање. E. coliJM110: F [trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15] dam dcm supe44 hsdr17 thi leu thr rpsl lacy galk ara tona tsx делта (лак-проаб) ламбда служеше како домаќин на истекот на плазмидите кои сечеа со ограничување на ендонуклеази чувствителни на метилација треба да биде. 2.1.2 Хемикалии Освен ако не е наведено поинаку, лабораториските хемикалии биле од Рот (Карлсруе) или Мерк (Дармштат) 2.1.3 Повторно користени пуфери и раствори TE пуфер 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pH 8,0 PBS (фосфатно пуфер Солен раствор) 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, 0,133 g CaCl 2 2H 2 O, 0,1 g MgCl 2 6H 2 O со HCl ph7.2 FACS пуфер 1 x PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN 3
36 loxp loxp pcd22-itim-ko tk neo 1112 13 14 15 насочувајќи геном. Locus loxp loxp tk нео рекомбиниран Locus Cre бришење loxp rec./ cre-delet. Локус егзон 11-15 мутираше ITIM (Y F) 1 kb Сл. 6: Тек на хомолошката рекомбинација на векторот pcd22-itim-ko со ендогениот CD22 локус. Последователното бришење на касетата за избор со Cre рекомбиназа ги остава мутираните ITIM во егзоните 13 и 15 и loxp секвенцата во интронот 14/15 како промени.
43 нео-сонда pcd22-3bs-hindiii сонда EBEBE 1112 13 14 15 9,5 kb WT EcoRI фрагмент генерал. Локус EB 11 kb WT BamHI фрагмент Б насочен кон EBE tk neo B loxp loxp EB рекомбиниран локус EE 9,5 kb рекомбиниран 3 kb рекомбиниран EB 9 kb рекомбиниран B 6 kb рекомбиниран мутација B exon 11-15 (стоп кодон) Сл. 11: ЦД22 локус и локус од див тип, комбинирани со pcd22-ex12-стоп со места за расцепување за ограничувачки ензими BamHI (B) и EcoRI (Е. ) Прикажаните фрагменти резултираат по варење со EcoRI или BamHI. Промените во фрагментите за ограничување на дивиот тип (WT) се јавуваат за време на рекомбинацијата преку EcoRI интерфејси во нео-касетата или преку BamHI интерфејсот во букварите за мутагенеза.
44 а) 11kb wt/wt wt/tail без опашка M12.2.3 M12.4.1 б) 9.5kb wt/wt wt/без опашка M12.2.3 M12.4.1 9.5kb 9kb 6kb 3kb варење: BamHI сонда: pcd22-3bs-hiii варење: EcoRI сонда: pcd22-3bs-hiii в) wt/без опашка wt/wt M12.2.3 M12.4.1 9kb варење на храната: BamHI сонда: нео Сл. 12: Јужни флеки на правилно рекомбинирани клеточни клонови на ES22-Tailless M12 .2.3 и М12.4.1, секој прикажан со контролен клон од див тип (wt/wt). Шематски приказ на локус од див тип и рекомбиниран локус, фрагменти што произлегуваат од варење со EcoRI или bamhi и сонди, видете на слика 11. а) CD22-ITIM-KO геномска ДНК на клоновите CD22-ITIM-KO идентификувани како позитивни вари со BamHI. Варењето на BamHI на локус од див тип резултира со фрагмент на ограничување од 11 kb. Интегрирањето на конструкцијата pcd22-itim-ko во локус од див тип го зголемува ова
45 фрагмент на 14 kb. Pcd22-3bs HindIII и сондата во внатрешноста на нео-касетата повторно беа користени како сонда. Слика 13. pcd22-3bs-hindiii-sonde neo-sonde BBB 1112 13 14 15 11 kb WT BamHI фрагмент Б генерал. Лоцирање на локус на рекомбиниран локус B loxp tk neo loxp BB 14 kb рекомбин. Фрагментот BamHI B exon 11-15 мутирал ITIMs (Y F) 1 kb Сл. 13: СД22 локус и локус од див тип, комбинирани со pcd22-itim-ko со места за расцепување на ензимот за ограничување BamHI (B). Прикажаните фрагменти настануваат по варењето на храната со BamHI. Со интегрирање на касетата neo/tk, рекомбинираниот локус се зголемува за 3 kb во споредба со локус од див тип. Како пример, на слика 14 е прикажан размаз на Southern на CD22-ITIM-KO клоновите YFtar3F1 и YFtar10E3. Размалките покажаа дека YFtar3F1 и YFtar4E6 се ослободени од дополнителни интеграции. За YFtar10E3, сепак, друга копија од конструкцијата е пронајдена во геномот (не е прикажано).
57 pcd22-itim-ko loxp loxp 1 kb tk neo 1112 13 14 15 1) Наоѓање на геномската низа 2) Развивање стратегија за клонирање 3) PCR клонирање 4) Секвенционирање 5) Бришење на HSV-tk loxp loxp neo 8 9 10 1112 13 14 15 129/ola pcd22-itim-ko-ext-t exon 8-15 мутирани ITIM (YF) Сл. 17: Да се зголеми фреквенцијата на хомологна рекомбинација на C57BL/6 векторот pcd22-ITIM-KO во неизогено 129-ES клеточни линии, векторот беше продолжен со ПЦР-засилено парче ДНК E14Tg2a. Предуслов беше наоѓање на скоро целосна низа на глувчето CD22 во пребарување база на податоци. Изведен е експеримент за таргетирање во ЕС-клеточната линија WW6 со средната фаза на двата вектори pcd22-itim-ko-ext (не е прикажано) прикажано на сликата (види го текстот).
58 Конструирај Без опашка (03/99) ITIM-KO (11/99) Без опашка (05/00) ITIM-KO (05/00) ITIM KO (06/00) ES клеточна линија Број на клонови прикажани PCR позитивни PCR репродукции C57BL/6-III 300 8-4 C57BL/6-III 500 5 3 3 C57BL/6-III 200 3 2 2 C57BL/6-III 150 2 2 2 Southern Blot C57BL/6-III 400 0 - - - сменети услови на култура: Нов медиум, бирање PBS, Pen/Strep, Gln, β-me ITIM-KO (08/00) бирање според PCR-Optim. Без опашка (08/00) бирање според PCR-Optim. ITIM-KO (11/00) Tailless (11/00) ITIM-KO (02/01) Tailless (07/01) BALB/cI 600 0 - - - 150 1 0 - - BALB/cI 600 1 0 - - 600 7 0 - - C57BL/6-III 500 6 2 - C57BL/6-III 400 12 11 - E14Tg2a 500 2 0 - - E14Tg2a 650 2 0 - - Дез. M12 2.1, 2.3, 4.1, 4.2 YFtar3F1, 4E6, 10E3 M12 8D1, 10D5 YFtar12B5, 12A4 YFtar29D2, 30F1 M12 15F5, 17B3,17B7, 17C7,18A3, 18B5,19A1, 19F2,21C4E, 21E5 -itim-ko pcd22-itim-ko-ext-tk, користете ESGRO ITIM-KO (10/01) WW6 400 0 - - - ITIM-KO E14Tg2a 960 0 - - - Таб. 1: Преглед на сите експерименти со насочување на гени на оваа докторска теза и добиените хомолошки рекомбинирани клонови
59 месечно/година инјектор за паѓање на клонови, младо парење 05/00 M12 2,3 M12 4,1 приближно P 30 приближно P 30 06/00 YFtar3F1 приближно P 21 09/00 M12 10D5 прибл. P 17 09/00 YFtar12B5 приближно P 17 YFtar3F1Cre C/B2 приближно Р 32 Б. Ледерман Б. Ледерман Б. Ледерман Б. Ледерман никој - никој - никој - 2 химера Б. Кнејц нема - со BL/6, без пренос на герминативна линија 12/00 12/00 01/01 03/01 03/01 04/01 05/01 07/01 08/01 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2, C/B4 YFtar3F1Cre B1 YFtar12B5 Cre S2F4, S2B2 S1C8 YFtar12B5 Cre S1F7, S2F7 YFtar12B5 Cre S1A1, S3A7, S3D8 YFtar12B5 CreS3B8 приближно P 32 B. Kneitz 8 момчиња, 4 од нив химерични приближно P 32 B. нема - приближно P 32 Ledermann никој - приближно P 34 B. Kne 2 мртви, 6 мртви - приближно P 32 приближно P 26 приближно P 26 B. Kneitz B. Kneitz B. Ledermann 5 момчиња, 1 од нив химеричен 7, 1 висок химеричен (умрен) никој - приближно P 27 B Kneitz никој - прибл. П 27 Б никој од Kneitz - прибл. P 28 B. Kneitz нема - со BL/6, без пренос на герминативната линија со BL/6, без пренос на рбетната линија n - Таб. 2: Преглед на сите инјекции на бластоцисти извршени за време на оваа докторска теза на хомолошки рекомбинирани и целосно карактеризирани клеточни клонови на ES
63 вектор pcd22-itim-ko во врска со прекинатата врска SHP-1 многу веројатно. 149 39 35 CD22-ITIM-KO 4A1 147 53 48 CD22-ITIM-KO 6D4 140 48 35 CD22-wt Ib.D4 148 37 41 CD22-wt Vb.C3 4 6 Контролен IgM CD22 a2,6-сиа Сл. 18: Површинска експресија на ЦД22 и а2,6-сиалинска киселина на клоновите J558L-CD22-wt и J558L-CD22-ITIM-KO избрани за истрага на тирозин фосфорилација и SHP-1 асоцијација на CD22. Изразот на површинските маркери е прикажан како хистограм, MFI е даден за секој хистограм.
68 WT CD22 -/- 55,5 89,5 10,5 6,5 95,5 58,7 4,5 2,8 43 67 20,9 33 59,5 92,1 7,9 5,1 B220 + Сиалидаза NeuGc-SA 63,5