Индукција на забрзана атеросклероза кај глувци Протокол за модел на повреда на жица (во превод на
Резиме
Оваа студија опишува инвазивен метод за поттикнување на забрзана атеросклероза кај глувци. Во споредба со другите методи кои користат електрични или крио-индуцирани повреди, механички предизвиканата повреда ја имитира човечката состојба на рестеноза по терапиите со реваскуларизација и е идеална за проучување на вклучените молекуларни механизми.
Апстракт
Атеросклерозата е пролиферативна фибро-инфламаторно заболување кое се развива во артерискиот wallид и предизвикува дефицитен проток на крв или недостаток на проток на крв. Покрај тоа, артериосклерозата предизвикува формирање на оклузивен тромб преку прекин на неисправниот wallид на крвниот сад, што е главната причина за миокарден инфаркт или мозочен удар и најчеста причина за смрт. И покрај напредокот на кардиоваскуларното поле, многу прашања остануваат неодговорени и дополнителни основни истражувања се од суштинско значење за да се подобри нашето разбирање за молекуларните механизми вклучени во атеросклерозата и нејзините импликации. Поради ограничени клинички студии, потребни се репрезентативни модели на животни кои симулираат атеросклеротични болести, како што се формирање на неоинтимали по имплантација на стент, ангиопластика со балон или ендартеректомија. Бидејќи глушецот има многу предности и е најшироко користен модел за проучување на молекуларни процеси, сегашната студија предлага инвазивен метод на ендотелијална денудација, исто така познат како модел на повреда на жица, кој е репрезентативен за човечката состојба на формирање на неоинтима во артериите по процедурите на реваскуларизација е.
Вовед
Главниот недостаток на моделот на глувчето е малата големина на главните артерии изложени на атеросклеротична болест (каротидна артерија, аорта и феморална артерија) за кои е потребно квалификувано хируршко знаење и вештини за манипулирање со садовите и инвазивно индуцирање на атеросклеротична плоча. Затоа, моделот на забрзано формирање на неоинтима предложен во овој труд во контекст на рестеноза по ендартеректомија или стентирање е претставен со чекор по чекор упатство и предлози за да се олесни воведувањето на заинтересираниот персонал. Друг недостаток е што денудацијата се јавува на нормалниот артериски wallид и затоа формирањето на нео-интима ќе биде умерено во споредба со клиничката состојба. Високите нивоа на плазма холестерол постигнати кај аполипопротеин Е нокаут (Апое -/-) глувци хранети со диета со висока содржина на маснотии создаваат соодветна про-воспалителна средина потребна за формирање на нео-интима.
Операцијата се изведува под стерео микроскоп. Каротидната артерија се изложува преку среден засек во предната цервикална област. Анатомските структури на и околу каротидната артерија се минимално изманипулирани за да се намали постоперативното воспаление. Бифуркацијата на каротидната артерија е суспендирана. Со цел да се предизвика забрзано формирање на неоинтима, внатрешните и надворешните каротидни артерии се подготвени за пресретнување на протокот и последователното често одбивање на каротидната артерија. Сумирајќи, методот може да го научат вработените со минимално искуство во хирургија на животни.
Протокол
Експериментите презентирани во овој труд се вршат според германскиот закон и европските упатства за грижа на животните. Theивотните се чуваат во објектот за животни на Институтот за лабораториски науки за животни, Универзитетска клиника Ахен, под раководство на проф. Р.Толба и Др. A. Teubner (службеник за благосостојба на животните) одгледан.
- Чувајте ги глувците во специјализирана единица за згрижување за да обезбедите соодветен пристап до храна и специјализирана ветеринарна контрола и третман. Доколку животните се преселени или купени од трето лице, ве молиме, обезбедете еднонеделен период на домување пред да ја поминете постапката.
- Стари 6 - 8 недели, хранат 18 - 20 g, жени (по избор) ApoE -/- глувци со атерогена диета (21% маснотии, 0,15% холестерол, 19,5% казеин, Wt/Wt) една недела пред хируршка интервенција и продолжете со диета додека не се направи анализа на атеросклеротични плаки.
3. Хируршка подготовка
- Отстранете ги повлекувачите и вратете го мускулниот слој и двете масни тела во физиолошката положба.
- Затворете ја кожата со три одделни 0/6 конци доколку се потребни ехокардиографски мерења. Ако не е потребно снимање, користете метални клипови за затворање на кожата.
- Ставете го глувчето под инфрацрвената светлина од левата страна додека не се разбуди. Не оставајте животно без надзор или со други животни додека не се опорави целосно.
- Означете го глувчето за идна идентификација со локалниот систем. Прашајте го службеникот за благосостојба на животните во локалниот објект.
6. Анализа на атеросклеротична плоча
Резултати од репрезентацијата
Постапката за индукција на атеросклеротична плака трае 15-20 минути и покажува минимална стапка на смртност, главно поради крварењето што се случува за време на постапката. По операцијата, глувците се опоравуваат од анестезија во рок од 20-25 минути. Не се забележани физички оштетувања, како што се парализа или нарушувања во исхраната, по операцијата.
Повредата на жицата предизвикува деендотелизација, која имитира лезии на садовите по ударање на балон или имплантација на стент. Веднаш по повредата, разголениот васкуларен wallид ќе биде покриен со слој на тромбоцити што посредува и ја фаворизира адхезијата на моноцитите 12. Активираните мазни мускулни клетки од медиумите се размножуваат и мигрираат кон интимните простори што ја формираат неоинтимата. Другите претходници на мазни мускулни клетки мигрираат од крвта (околу 40%) и придонесуваат за раст на неоинтималите. Формирањето на плаки завршува по целосна ре-ендотелизација, обично 4 недели по повредата на жицата.
Формирањето на неоинтима може да се процени со боење на Movat. Големината на плочата се пресметува за секој филм со користење на софтвер, како во Слика 2Bприкажано. Вкупната големина на плочата (левата каротидна артерија) може да варира од 70 000 до 100 000 м2, додека големината на контролниот сад (десната каротидна артерија) може да варира помеѓу 7000 и 8 000 м2. Овие вредности во голема мера зависат од хирургот. Затоа, силно препорачуваме да користите ист хирург за истата студија во текот на експериментите.
Развиената плоча наликува на рестеноза на стент, која претежно се состои од реплицирани и мигрирани клетки на мазни мускули од медиумите. во стент Клеточниот состав утврден со имунолошко боење покажува дека содржината на мазните мускулни клетки е околу 30-40%, додека макрофагите се наоѓаат во 15-25% од неоинтимите на повредениот сад. Реендотелиализацијата може да се измери откако ќе се обои ендотелијален маркер и се пресметува како процент на обемот обоен во целиот обем на луменот. Како по правило, повторната ендотелизација достигнува 80 - 90% по 3 недели и треба да биде скоро завршена по 4 недели (Слика 2C) За да се следи растот на плаките како што се развива, истата анализа може да се повтори за секоја точка во времето по повредата на жицата, во зависност од интересот и проучената тема (види Табела 1).
Дискусија
Во овој пост, ви даваме корисни совети за изведување на постапката за повреда на жицата дури и од вработени со минимално искуство во операција на животни. Постојат два критични чекори во спроведувањето на оваа постапка: засечување на надворешната каротидна артерија и вметнување на жицата. Засекот во надворешната каротидна артерија мора да се направи што е можно подалеку од бифуркацијата за да се обезбеди доволен остаток на материјал (Слика 1C) Засекот не треба да биде преголем бидејќи постои ризик од сечење на целиот сад. Вториот критичен чекор е високиот ризик од крварење за време на артериотомијата и вметнувањето на водичката жица ако протокот на крв не е ефикасно контролиран. Покрај тоа, ако водечката жица не е правилно вметната во садот со лумен, не може да се појави ендотелијална денудација или прекин на артеријата. За да се избегне ова, површината на водечката жица мора внимателно да се полира пред работата.
Со цел да се оптимизира протоколот, позицијата на операционата маса со главата на глувчето во правец на хирургот обезбедува подобра видливост, пристапност и контрола за правилна манипулација со жицата со водилка. Покрај тоа, за да се зголеми репродуктивноста, користете го истиот водич во сите студии. Бидејќи големината на жицата не се менува, важно е да се земат предвид и отстранат сите можни разлики помеѓу глувците со користење на ист пол, возраст и тежина за сите глувци вклучени во една студија. После тоа, боењето Еванс-Блу ќе му помогне на хирургот да ја утврди ефикасноста на денудацијата. Достапноста на соодветна опрема е предуслов за успешна постапка. 10x стерео микроскоп е неопходен за извршување на оваа постапка. Правилната подготовка на водечката жица (на пример, полирање) е клучна. Затоа, силно препорачуваме подготовката на жицата да ја спроведува специјализиран технички персонал, доколку е достапен.
Овој дневник има многу чекори за смена на проблеми. Ако ја исечете надворешната каротидна артерија во близина на бифуркацијата, внимателно врзете ги надворешните делови во близина на бифуркацијата, за да не дојде до крварење. Надворешната каротидна артерија не може да се види при сечење. Затоа, разгледајте ја бифуркацијата на ниво на свилен конци. Соберете делови кога ќе исчезне свиленото цвест. Ако засекот во надворешната каротидна артерија е преголем и садот е скршен, проверете дали протокот на крв во каротидната комуниса и внатрешната каротидна артерија е ефикасно отсечен и обидете се да најдете отвор на садот со форцепс. По вметнување и разголување на жица, врзете го садот во близина на бифуркацијата. Додека сечете, започнете да собирате кога свилата почнува да исчезнува од цвест. Ако се појави артериска руптура за време на денудацијата со водилката, проверете под микроскоп дали водичот е правилно полиран.
И покрај сличноста на моделот на повреда на жицата со клиничките ситуации, многу групи се фокусираат на домородна атеросклероза кај глувци или избираат инвазивни индукции на атеросклероза, како што е ангиопластика со балон кај стаорци или зајаци, поради недостаток на обучен персонал, способен да изведува операции со животни од мал обем. И покрај предностите на користење зајаци/стаорци на пр. Без минијатуризирана опрема, на пример, ниту модели на стаорци, ниту модели на зајаци не нудат широк спектар на различни нок-аут соеви за проучување на молекуларните механизми вклучени во неоинтимален раст и тромбоза во стент.
Денудацијата се изведува на нормалниот артериски wallид, иако со атеросклеротична позадина. Затоа, формирањето на неоинтима ќе биде умерено во споредба со клиничката состојба. Големиот број на претклинички модели покажува дека ниту еден од моделите не ги исполнува сите критериуми потребни за да се открие целокупноста на клеточните и молекуларните механизми што доведуваат до патофизиологија кај луѓето (види Табела 2).
По завршувањето на постапката за повреда на жицата, може да се извршат други биолошки и молекуларни анализи за да се идентификуваат клетки, протеини, mRNA, микроРНК, гени или други биомаркери кои можат да се користат како терапевтски цели за развој на нови стратегии за третман на атеросклероза, а особено за формирање на неоинтима по васкуларна повреда . Доколку е достапно, растот на плаките може да се следи со ултразвук со висока фреквенција или други техники за сликање со висока резолуција. Покрај тоа, совладувањето на оваа техника ќе му овозможи на операторот да го прилагоди протоколот на други инвазивни модели на индукција на атеросклероза, како што се: Б. Поставување на јака, делумна лигатура или дури и имплантација на стент.