Инјектирање инсулин и екстракција на хемолимфа за мерење на чувствителност на инсулин кај возрасна дрозофила
Резиме
Зачуваните патеки за сигнализација на инсулин пронајдени во овошната мушичка Дрософила меланогастер го прават овој организам потенцијална алатка за моделирање на метаболички заболувања како што е дијабетес тип II. За таа цел, важно е да се утврдат физиолошки тестови за ефикасно мерење на системските ефекти на инсулин врз периферната гликоза достапна кај мувата за возрасни.
Апстракт
Протокол
1. Инсулин што го прави растворот
- Подгответе свеж говедски инсулин со растворање на инсулин во PBS за да се постигне концентрација од 0,01 mg/ml. И инсулинот/PBS и контролните PBS раствори мора да се чуваат на мразот за време на инјекцијата. Овие раствори не треба да се подготвуваат со 0,5% (v/v) FD&C Blue. 1 боја на храна.
2. Подготовка на игла и поставување на инјектирање
- За експерименти со инјектирање се користат женски муви стари десет дена. Соберете муви во рок од 24 часа по изведувањето. Анестетизирајте муви со навлажнета CO 2 на подлога за гас, средувајте мажи и ставајте ги женските муви во шишенца со стандардна или диета за третман. Чувајте ги женските муви на експериментална диета 10 дена.
- Десеттиот ден по изведувањето и одделувањето на експериментални диети, мувите се префрлаат од нивните шишенца што содржат храна во ампули со 5 мл приклучок што содржи 2% агар и ги гладуваат 12-16 часа.
- Пренесете ампули од гладни муви со 10% натопени филтри со гликоза 1 час пред инјектирање на инсулин.
- Накратко анестезирајте ги мувите со навлажнет CO 2 по снабдувањето со гликоза и потоа имобилизирајте ги студени на мраз.
- Зафатете ладна имобилизирана мува со фини форцепс и држете го врвот на иглата блиску така што врвот е покрај предната област од левата страна на градниот кош на мушичката. Донесете ги и врвот на иглата и тораксот на мува во фокусот под стерео микроскоп.
- Поместете ја мувата кон врвот на иглата така што врвот на иглата да го допира центарот на грбните делови на левиот прескутум регион на градниот кош на мувата (слика 1). Откако мувата е правилно порамнета и е во согласност со врвот на иглата, мувата продолжува на иглата така што иглата го лепи центарот на пресутумот напред.
- Нанесете позитивен притисок со унапредување на клипот за шприц со микроинјектор со помош на копчето микроманипулатор додека не се инјектира 0,1 μl течност при летање. Протокот на течност во летачката хемоцела ќе даде сина боја на левата страна на предниот градниот кош. Повремено, треба да се повлечете и напредувате неколку пати со цел да ги олабавите сите блокади на точката на иглата и да дозволите проток.
- Оставете инјектирани муви во ампули од агар од 2% за одредени временски точки да се опорават пред екстракција на хемолимфа.
6. Одредување на хемолимфна гликоза
- Исфрлете примероци од хемолимфа во бунари на микротитер со 100 μl реагенс за Infinity Glucose. Чувајте ја плочата на мраз при вчитување примероци од хемолимфа.
- Направете стандардна крива со вчитување одделно 1 μl од растворите на залиха на гликоза на 50мм, 25мм, 12,5мм, 6,25мм и 3,125мм.
- Инкубирајте ги примероците на 37 ° C 10 минути.
- Откријте ја апсорпцијата на 340 nm.
- Сметајте за собраниот волумен на хемолимфа и утврдете ја концентрацијата на глукоза во примерокот врз основа на стандардната крива со познати концентрации на глукоза.
7. Репрезентативни резултати
Типичен одговор на толеранција на инсулин е во мувите за инјектирање на инсулин, каде што се открива намалување на нивото на циркулирачка гликоза 15 минути по инјекцијата. Спротивно на тоа, таквата реакција не е во мушички инјектирани PBS (слика 3). Оваа реакција во периферната гликоза достапна во инјекцијата на инсулин продолжува да лета до 30 минути по инјекцијата. Ние рутински извлекуваме 0,2-0,5 μl хемолимфа на 4-5 муви во секоја група на инјекции. Три групи за инјекции се вклучени во секој експеримент.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Дискусија
Техниката опишана во овој извештај е потенцијална корисна за секоја студија што ги испитува физиолошките процеси што резултираат во забележливи промени во составот на хемолимфата Дрософила. Со комбинирање на инјектирање и собирање хемолимфи на овој начин, можно е да се утврдат непосредните физиолошки релевантни ефекти на одреден експериментален третман или манипулација. Примарната предност на оваа техника "крварење" при собирање на хемолимфи во споредба со претходните процедури кои вклучуваат обезглавување 2 е тоа што оваа техника ја минимизира контаминацијата на примероците на хемолимфа со добра содржина. Доколку се внимава да се избегне каква било перицеребрална маст што понекогаш е присутна во телото се појавуваат собираат зрачени капки хемолимфа, а примероците треба точно да ја рефлектираат состојбата на ин виво циркулаторните течности.
Потенцијално збунувачки фактор изведен како резултат на експеримент за инјектирање од оваа скала е првото разредување на вкупните циркулаторни течности по инјекцијата. Ова лесно може да се контролира, но откако ќе се инјектира ист волумен на PBS во експериментални муви или инсулин во контроли според возраста и нормализирање на резултатите. За да се обезбеди репродуктивно читање на циркулирачката гликоза, квалитетот на капките на хемолимфата е од огромно значење. За одредување на гликозата, треба да се евидентираат само чисти капки хемолимфа без перикеребрални масни тела или други остатоци од ткиво. Забележително е и дека треба да се соберат само до 8 примероци пред да се утврдат релативните концентрации на глукоза. Забележавме „лебдат“ во отчитувањата на OD 340 кога примероците од хемолимфа беа оставени на мраз подолг временски период.
Нашиот протокол остава многу простор за промени во достапната опрема. Поставките за влечење на пипети треба да се променат врз основа на моделот и состојбата на влечникот. Откривме дека поставките за правење адекватни игли за електрода на интрацелуларен навлегување се идеални за хиподермични игли. Покрај тоа, додека користевме микроманипулатор со три оски за одржување на позицијата на иглата под стереоскопот, ова исто така може да се постигне со стабилен држач за прстен и систем за стегање кога иглата останува во фиксна положба преку процесот на инјектирање. Големата отпорност на употребените игли наложува развој на алтернативен метод за одредување на волуменот на инјектираната течност како движење на клипот 1: 1 со цел да не се постигне поместување на волуменот. Развивме скала што може да се отпечати и измеша на страната на иглата. Во зависност од користениот систем, можеби ќе биде потребно да се измести малку течност од иглата надвор од држачот на иглата на микроинјекторот, така што течноста на менискусот може да се порамни со градации со помош на картата за калибрација прикачена на страната на вратилото на иглата.
Конечно, две ограничувања на оваа техника се забележани во нашиот протокол. Прво, од две лица обично се бара да ги координираат чекорите за инјектирање и екстракција на хемолимфи, со цел да се зголеми бројот на обработени примероци. Второ, понекогаш се забележуваат варијации во одговорот на толеранција на инсулин во рамките на истиот генотип. Ние веруваме дека преку варијабилни реакции индивидуалните муви можат да следат имобилизација на мраз и обновување на агар. Затоа, треба да се испита доволен број примероци пред да се извлечат сигурни заклучоци.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.