Метод за сликање со полу-висока пропусна моќ и Алатник за визуелизација на податоци за да се анализира Ц.

Резиме

Оваа работа опишува протокол со полу-висока пропусност што овозможува истовремено 3Д-временско снимање на ембриогенеза кај ембриони од 80-100 C. elegans во едно ноќно трчање. Вклучени се и алатки за обработка на слика и визуелизација за да се оптимизира анализата на податоците. Комбинацијата на овие методи со прилагодени соеви на известувачи овозможува детално следење на ембриогенезата.

Апстракт

Вовед

Ембрионот C. elegans е важен модел на систем за механичка клеточна биологија и анализа на спецификацијата на клеточната судбина и морфогенетските настани што го поттикнуваат развојот на ембрионот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. До денес, голем дел од карактеризацијата и на настаните на клеточно ниво и на спецификациите на судбината на клетките во ембрионот е постигнат со релативно висока експерименти со временска резолуција со употреба на флуоресцентни маркери. Иако овој пристап работи добро за настаните од редот на секунди до десет минути, тој станува технички ограничувачки за карактеризирање на подолги процеси по редослед од часови до денови. Ембрионалниот развој од првото деколте до крајот на истегнувањето трае околу 10 часа. Во овој временски план, методите на полупропусност што ќе овозможат истовремено снимање со помала временска резолуција (т.е. стекнување во 5-20 мин. Временски интервали) на поголеми групи ембриони од различни услови, ќе отворат нов сет на експерименти; z Овозможување систематски напори за скрининг од големи размери и анализа на доволен број ембриони за споредба на последиците од молекуларните нарушувања.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

1. Подгответе ембриони на C. elegans за слики со голема пропусност

ЗАБЕЛЕШКА: Целта на овој дел од протоколот е да се генерира популација на полусинхронизирани (2 до 8 клетки фаза) ембриони C. elegans кои се расечени од соодветни соеви на маркери (Слика 2) во стаклено дно 384 бунар за слики. Другите формати на плочи би можеле да работат исто така, но плочите од 384 бунари се претпочитаат затоа што малата големина на бунарот го ограничува ширењето на ембрионот на релативно мала област, што го олеснува идентификувањето на полињата што содржат повеќе ембриони за временски снимање. Приближната синхронизација на ембрионите осигурува дека целиот процес на развој за секој ембрион во одредено поле е снимен.

2. Оценување на ембрионална леталност

  1. Скенираните полиња се користат за проценка на ембрионална леталност и дефекти на ларвата со броење на изведените црви и нераспределените ембриони за секој бунар.
  2. Постигнете незавршени ембриони како ембрионална фаталност. Исклучете ги уапсените ембриони од една до четири-клетка од резултатот на фаталност, бидејќи младите расечени ембриони понекогаш не успеваат да го комплетираат формирањето на лушпа од јајца (ако мејозата II сè уште не е комплетна) и дефектите на пропустливост може да доведат до осмотски компликации во првите две години. Деловни области.
  3. Резултати на делумно изведени или целосно изведени црви со телесна морфологија или нарушувања во однесувањето, како што се нечисти или парализирани, како „абнормална ларва“.

3. Автоматско сечење (слика 3А.)

ЗАБЕЛЕШКА: Софтверот е сместен на две локации: (1) Зенодо сместува лесна верзија на софтверот 12 што не бара никакво знаење за програмирање. (2) Гитуб содржи изворен код за нашиот софтвер embryoCropUI.py и screenCrop.py 13, за кои е потребно познавање на Python. Подолу се дадени детални упатства за тоа како да преземете и ракувате со двете верзии на програмата.

4. Визуелизација (слика 4))

ЗАБЕЛЕШКА: OpenandCombine_embsV2.ijm 10, 12 е макроа ImageJ што создава лесно препознатлива датотека tiff од сите слики за даден дел и состојба. Потребна е инсталација на FIJI/ImageJ 14, 15. Ова макро е извршено во согласност со нашата структура на датотеки. Треба да се смени за да работи со различни структури на датотеки. Инструкции за правилната структура на датотеката и детален опис на важните размислувања може да се најдат на крајот од Датотека GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx во складиштето Зенодо. Прочитајте ги овие упатства целосно пред да ги прегледате правилно именување и структурирање на слики за датотеки за најдобар интерфејс со ова макро. За повикување, нашата структура за локација на датотека изгледа вака:
Z: -прилагодено, Target'Strain'Emb'Target_Emb'_15 Единствен идентификатор на бројки _W '# F_T' #_ Z '#_ C'.tif
на пр. Z: -сечен-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Главен предизвик во карактеризирањето на влијанието на молекуларните нарушувања врз ембрионалниот развој на C. elegans е дека потребни се приближно 10 часа за да напредуваат ембрионите од првото деколте до крајот на истегнување на 20 ° 16. Пристапот на полупропусност, што овозможува истовремено да се сликаат големи групи на ембриони, е корисен за настани во овој временски план, бидејќи овозможува паралелно мапирање на повеќе услови со доволна големина на ансамблот за секоја состојба за да се овозможи квантитативна анализа (слика 1А.).

сликање
Слика 2. Прилагодени соеви генерирани за снимање со висока резолуција на ембриогенезата на C. elegansбеа. (А.) Шемите ги илустрираат трансгените кои се користат за конструирање на соеви на герминативниот слој (горе) и морфогенеза (долу). (Б.) Проекционите површини со максимален интензитет го покажуваат текот на времето на развој во соединенијата морфогенеза (горе) и герминативниот слој (подолу). Вентралниот приказ е прикажан како што е прикажано на дијаграмите на колото (лево). Времето е во однос на децималната точка (t = 0), што е лесно препознатливо во обете стебла. Скала лента = 10 м Слика со дозвола од Ванг и сор. 10 репродуцирани. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

пропусна
Слика 3. Програмата за обичен сечење ги изолира и ориентира одделните ембриони од полињата за слики. (А.) Шемата ја илустрира функционалноста на програмата за сечење на ембриони и ги потенцира двете опции за пристап до оваа програма: лесен за кориснички интерфејс GUI што не бара знаење за програмирање и се базира на Зенодо (лево) и сериска верзија на програмата, Пајтон Потребно е искуство и е достапно на Github (десно). (Б.) Графиконот го сумира алгоритмот за автоматско сечење - се создава бинарна маска од 8-битни светли слики, а индивидуалните ембриони се препознаваат, исекуваат и порамнуваат по предната задна оска. Скалата е 10 м. (Ц.) Шематски го опишува процесот што се користи за итеративно препознавање на ембриони во бинарната маска. (Д.) Шематски го илустрира методот за ориентирање на ембриони долж оската на предната и задната страна. Панелите Б-Д се репродуцираат со дозвола од Ванг и сор. 10 Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

полу-висока
Слика 4. Прилагодената макро ImageJ овозможува да се визуелизираат податоците за скринирање на RNAi преку генерирање композитни датотеки за секоја состојба. (А.) Прикажани се ембриони за три примери на РНКii состојби од 40 генски тестови (видете Ванг и сор. 10, 11 за целосната база на податоци) (десно), нагласувајќи ги различните фенотипови на потпис што се заеднички за секој и репродуктивност фенотипите во рамките на секоја состојба. Панелот е направен со дозвола од Ванг и сор. 10 адаптирани. (Б.) Контролниот панел илустрира како прилагодената макро ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm) гради ембриони од специфична RNAi состојба во композитна датотека ImageJ што поставува светлосни и максимални интензитетни проекции за секој ембрион во секој момент. Иако е нагласен само еден пример, ова макро може истовремено да ги собере податоците за многу услови на RNAi. ImageJ макро е достапна на Зенодо 12. Скала лента = 10 м. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа илустрација.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Заедно, методот на филм со полу-висока пропусност, заедно со алатките за сечење на ембриони и обработка на слики опишани овде, ќе ја олеснат анализата на ембрионалниот развој на C. elegans со различни мутанти, нарушувања и обележувања на обележувачи. Во моментов во тек е голем екран во нашата сопствена лабораторија со користење на овие методи за снимање на ембриони од двата нарачани соја опишани овде откако беа потребни 2000 гени да се развијат. На крајот, податоците од овие напори ќе послужат како друг извор за зајакнување на напорите за разбирање на спецификацијата на клеточната судбина и морфогенетските настани за време на ембриогенезата.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.