Нуклеозомите како параметри на клеточна смрт кај пациенти со малигни тумори - PDF бесплатно преземање
Од Институтот за клиничка хемија при Извршниот одбор на Лудвиг-Максимилијанс-Универзитет Минхен: проф. Д-р х.ц. Н. нуклеозомите на Сајдл како параметри на клеточна смрт кај пациенти со малигни тумори Дисертација за стекнување на докторска диплома по медицина на Медицинскиот факултет на Универзитетот Лудвиг Максимилијанс во Минхен презентирана од Стефан Холденридер од Јетинген-Шепах 24
II Со одобрение на Медицинскиот факултет на Универзитетот во Минхен 1. Известувач: проф. Д-р х.ц. Д. Зајдл 2-ри известувач: проф. C. Нерл ко-известувач: прив. Доз Р. Холе Проф. Др. J. P. Johnson Ко-надзор од страна на вработените во д-р: Др. Петра Стибер Дин: Проф. Д-р х.ц. K. Peter Ден на усното испитување: 15.1.24
III Посветен на моите родители
IV Претходни публикации: Апликација за патент: Roche Diagnostics, Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Schalhorn A Следење на терапијата кај пациенти кај кои апоптозата е предизвикана како резултат на болест или терапија, со откривање на апоптотик производи. Број на патент: 4918/OA/WO - Ts Оригинални статии: Holdenrieder S, Stieber P, Förg T, Kühl M, Schulz L, Busch M, Schalhorn A, Seidel D Апоптоза кај серум кај пациенти со цврсти тумори Антиканцер Рес. 19: 2721-2724 (1999) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Ready G, Fürst H, Schmeller N, Untch M, Seidel D нуклеозоми во серумот како маркер за клеточна смрт Clin Chem Lab Med 39: 596-65 (21) Holdenrieder S, Нуклеозоми во серум на пациенти со бенигни и малигни заболувања на Стибер П, Боденмилер Х, Буш М, Реди Г, Фирст Х, Шалхорн А, Шмелер Н, Унч М, Зајдл Д (Рад Онкол) 95: 114-12 (21 ) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, v Pawel J, Schalhorn A, Nagel D, Seidel D Циркулирачки нуклеозоми во серумот Ann NY Acad Sci 945: 93-12 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Квантификација на нуклеозомите во серумот со откривање на клетките на смртта ЕЛИСА плус Биохемика 1 (22): 25-27
VI СОДРИНА 1 ВОВЕД И ПРАШАЕ I 2 ОСНОВА 4 2.1 СЛАТА НА КЛЕТКАТА 4 2.1.1 ИСТОРИЈА НА ИСТРАУВАЕТО НА КЛЕТНА СОСТОЈБА 4 2.1.2 МОДЕЛ ДИХОТОМСКИ КЛЕТА МОДА 1 2.1.3 ИНТЕГРИРАН МОДЕЛ НА СМРТТА НА КЛЕТКИ 17 2.1.4 ЦЕЛА ДЕАТС ОД ПАЛЕШКО ПАЛСЕ 6 ГЕНЕТСКА РЕГУЛАЦИЈА НА СМРТАТА НА АПОПТОТИЧНИ КЛЕТКИ 28 2.1.7 СИГНАЛНИ ПАТИ НА СМРТТА НА АПОПТОТИЧНИ КЛЕТКИ 31 2.1.8 ПОИДИЦИ НА АПОПТОТИЧНА КЛЕТКА СМРТ 4 2.1.9 НАЧИН НА Откривање на Смртта на клетките 43 2.2 НУКЛЕОЗОМИ 2.2.3 Циркулација на нуклеински киселини во плазмата и серумот 68 3 Методолошки позадина на тестот за нуклеозомент 8 3.1 Имунхемиско откривање и мерење на методи 8 3.2 Методолошки основи ПАЦИЕНТИ 92 4.1.1 ЗДРАВИ ЛИЦА 92 4.1.2 ПАЦИЕНТИ СО БЕНГИЈАНИ БОЛЕСТИ 92 4.1.3 ПАЦИЕНТИ СО МАЛИГНАНСКИ БОЛЕСТИ 94 4.2 СТАТИСТИЧКИ МЕТОДИ 97 4.2.1 ОЦЕНКУВАЕ НА КЛИНИЧКО-ДИЈАГНОСТИЧКИ КВАЛИТЕТ 97 4.2.2 СТАТИСТИЧКИ ПОСТАПКИ ВО СРЕДНИ СЕКТОРСКИ СЕКТОРСКИ СЕКТОРСКИ СТЕКТОРСКИ СТЕКТОРСКИ СТЕКТОРСКИ СЕКТОРСАЛНИ СТЕКТОРСКИ СТЕКТОРСКИ СТЕКТОРСКИ 2
3 1. Дали спонтаните концентрации на нуклеозомот се различни кај здрави луѓе, пациенти со бенигни заболувања и пациенти со малигни тумори? Дали е можно да се дијагностицираат малигни заболувања? 2. Дали спонтаните концентрации на нуклеозомот се разликуваат во различни типови на тумор? 3. Дали спонтаните концентрации на нуклеозомот се разликуваат во однос на туморските карактеристики, како што се фазата, степенувањето или хистологијата? 4. Кои промени во концентрацијата на нуклеозомот произлегуваат од операции, инфекции и последователна антибиоза, како и за време на хемотерапија и радиотерапевтски третман? 5. Дали кај луѓето со малигни заболувања, промените во концентрацијата на нуклеозомот предизвикани од хемотерапија и радиотерапија се во корелација со клиничкиот одговор на терапијата и наодите за слики? Може ли да се спроведе терапевтски мониторинг со употреба на нуклеозоми? Колку безбедно и колку рано може да се процени ефикасноста на терапијата? 6. Дали концентрацијата на нуклеозомот за време на хемотерапија и радиотерапија е во корелација со другите онколошки биомаркери што се користат за контрола на ефикасноста на терапијата? Дали е можна споредлива или посигурна проценка на терапевтскиот успех со употреба на нуклеозоми?
6 Во раните 60-ти години на минатиот век, Р Локшин и Ц Вилијамс го користеа моделот на инсект за да ги проучат процесите за време на клеточната смрт и го измислија терминот програмирана клеточна смрт како просторно и временски предвидлив процес (Локшин 1964). Малку подоцна, Тата и повторно Локшин покажаа дека синтезата на макромолекулите е неопходна за оваа клеточна смрт. Тие беа во можност ефикасно да го спречат со РНК и протеински инхибитори (Тата 1966; Локшин 1969). Конечно, во 1971 година, F.он Ф. Кер ја опиша таканаречената некроза на собирање, низа на промени што ги забележа во индивидуални, умирачки клетки на црниот дроб, кои потоа станаа атрофирани, по оклузија на порталната вена на стаорци (Кер 1971). F.он Ф. Кер, Ендру Вили, Сер Алестер Кари Една година подоцна, заедно со Ендру Вили и Сер Аластер Кари, тој го воведе терминот апоптоза, термин земен од грчки што означува пад на лисјата на есен, и најавува нова ера на модерноста Истражување на клеточна смрт (Кер 1972). Слики 2-4 (Камингс 1997): Прва личност што ја опиша апоптозата Слики 5 и 6 (Кер 1994): Апоптотични клетки со типични морфолошки карактеристики
9 Слика 8: Хронологија на истражување на клеточна смрт
1 2.1.2 Модел на дихотомна клеточна смрт Од историски причини, откако Кер го воведе терминот апоптоза, првично беше направена разлика помеѓу типови на клеточна смрт што произлегува од надворешни и внатрешни стимули. Клеточното самоубиство е поделено на најмалку три вида: исхемична клеточна смрт, смрт на слободни радикали на клетки и генетски регулирана апоптоза (Мајно 1995). Како што е предложено од Гропер, вториот го формирал пандан на митозата. Некрозата првично беше сфатена макроскопски како остатоци од мртво ткиво. На клеточно ниво, некрозата беше опишана како пасивна клеточна смрт предизвикана од надворешни стимули, за разлика од внатрешните, активно спроведена деградација на клетките, т.е. апоптоза. Овие две форми беа применети на дихотомна мода на сите феномени на клеточна смрт; другите форми на клеточна смрт во голема мера беа игнорирани (Вили 198а; Кер 1994). Слика 9: Класичен модел на клеточна смрт (модифициран од Мајно 1995 година): кондензација на прекин на хроматин во плазматската мембрана на клеточното јадро, недопрена дехидрираност на апоптозата и собирање на клеточните апоптотски тела, оток на клетката и прекин на митохондријата на некрозата на плазматската мембрана
21 2.1.5 Клеточна смрт во патолошки процеси Клеточната смрт и пролиферацијата на клетките се наоѓаат во фино регулирана рамнотежа во организмот, како и во одделни органи и функционални системи. Доколку се наруши оваа рамнотежа, болестите можат да се развијат на сите нивоа: Пролиферација на хомеостаза Клеточна смрт Преовладување на стапката на пролиферација над стапката на клеточна смрт може да доведе до локални и системски малигни заболувања, како и до метаболички, воспалителни и некои автоимуни болести. Хиперпролиферативни заболувања Клеточна смрт Пролиферација Прекумерната клеточна смрт, од друга страна, е основа за развој на голем број дегенеративни, хематолошки, автоимуни, поврзани со исхемија, токсини и инфламаторни заболувања. Дегенеративни и деструктивни болести Пролиферација Смрт на клетките Преглед на важноста на смртта на клетките кај разни болести е составен во следната табела (Томпсон 1995; Фадеел 1999; Робертсон 22):
36 Регулирање на сигналните патишта За започнување и спроведување на апоптозата со посредство на рецепторот, беа идентификувани некои централни патеки на пренос на сигнал кои се заеднички за сите клетки и беа опишани некои променливи делови, во зависност од типот на клетката и агенсот за активирање. Заедничките карактеристики вклучуваат формирање на DISC од тримеризирани рецептори, FADD и иницијаторска пропаза 8, како и крајниот сегмент на ефекторните каспази, особено касказата 3, што доведува до активирање на клеточната структура и протеазите што го расцепуваат јадрото. Меѓу нив има три променливи делови: 1. директно активирање на каскадата касказа 2. вклучување на митохондриите со ослободување на цитохром C 3. активирање на митохондриите и ослободување на AIF според патот по кој можете да поминете за да извршите апоптоза може да се разликуваат два типа на клетки (Scaffidi 1998; Krammer 2a, b): CD95-L CD95-R Слика 18: Апоптотични сигнални патишта во клетките од типот I и тип II (модифицирани од Krammer 2a) FADD/MORT1 DD DD DD DD DD DD FADD Pro - CASP-8 DISC c-flip BID Bcl-2 Bcl-x L CASP-8 Cyto c - Apaf-1 CASP-3 CASP-9 CASP-8 AIF Смртни подлоги ТИП I Апоптоза ВИД ТИП
39 Бројни инхибитори на ефекторни каспази се групирани заедно како IAP (инхибитори на апоптоза). Во човечките клетки, овие вклучуваат XIAP (MIHA), c-iap-1 (MIHB), c-iap-2 (MIHC), NAIP и survivin. Тие започнуваат од активираните каспази 3 и 7 и од апоптозомот и значително се разликуваат во нивната инхибиторна моќ. (Cecconi 1999; Budjhardjo 1999, Thornberry 1998; Jäättelä 1999; Deveraux 1999; Goyal 21). Нивната важност лежи веројатно во фината регулација на сигналот за апоптоза. Ова е исто така поддржано со ослободување на дополнителни IAP-регулирачки протеини како што се Smac (втор активатор на каспази добиени од митохондрија) и DIABLO (директен IAP-врзувачки протеин со ниски pi) (Хенгартнер 2) за време на апоптозата. Илустрирани се најважните компоненти на сигналните патеки на апоптозата, вклучително и инхибиторните почетни точки: FADD/MORT1 DD DD DD DD DD CD95-L CD95-R FADD/MORT1 Оштетување на ДНК p53 Слика 19: Преглед на регулацијата на сигналните патишта кај апоптозата (модифицирана според Хенгартнер 2 и Росел 22) Pro- CASP-8 DISC BID Bcl-x L Bax Bcl-2 c-flip Bcl-2 Bcl-x L CrmA CASP-8 cytochrome c Pro-CASP-9 Bcl-x L Pro-CASP -3 АПАФ-1 апоптозом CASP-3 IAPs Smac/DIABLO AIF смртни подлоги апоптоза
62 Спирално извртување на ДНК суперхеликсот во нуклеозомот кој, откако ќе се олабават контактите на хистон-ДНК, се одвртува и го поместува хистонскиот комплекс (Видом 1997; Корнберг 1999). За функцијата на некои од овие комплекси, на пример, за факторот за ремоделирање на нуклеозомот NURF, потребно е вклучување на ацетилирани хистонски краеви. Преглед на комплекси за ремоделирање на кроматин е даден во следнава табела (Корнберг 1999): Извртување на промоторот П мрна к 12 П нуклеозом к 21 П ДНК и изложеност на ДНК прогресијата на транскрипцијата Р комплетен препис Слика 26: Ремоделирање на хроматин од ISWI комплекси (Widom 1997 година) Табела 8: Групирање и карактеристики на комплекси за ремоделирање на хроматин Комплекс за ремоделирање на хроматин Организам АТПаза Молекуларна тежина (MDa) Под-единици SWI/SNF семејство SWI/SNF S. cerevisiae SWI2/SNF2 2 11 RSC S. cerevisiae STH1 1 15 Брама Д. меланогастер Брама 2 ND H SWI/SNF H.sapiens hbrm 2 1 H SWI/SNF H.sapiens BRG1 2 1 NRD H.sapiens CHD4 1,5 18 семејство ISWI I SWI1 S.cerevisiae ISWI1,4 4 I SWI2 S.cerevisiae ISWI2,3 2 NURF D.melanogaster ISWI, 5 4 CHRAC D.melanogaster ISWI, 7 5 ACF D.melanogaster ISWI, 2 4 RSF H.sapiens hiswi, 5 2