Откривање геном на хуман метапневмовивирус (hmpv) кај хоспитализирани деца - Бесплатно PDF

Откривање геном на хуман метапневмовирус (hmpv) кај хоспитализирани деца Инаугуративна дисертација за добивање на докторска диплома на Високиот медицински факултет на Рајнише Фридрих-Вилхелмс-Универзитет во Бон, Томас Бернд Глатцел од Бон 2008 година

hmpv

Подготвено со одобрение од Медицинскиот факултет на Универзитетот во Бон 1. Рецензент: Дипл-Биол. Прив.-Доз. Д-р рер. нат Оливер Шилдген 2-ри рецензент: проф. Д-р. медицински Ден на усно испитување на Јирген Рокстрох: 27 октомври 2008 година медицински Публикација Ахим Харауф: Оваа дисертација е електронски објавена на универзитетскиот сервер за објавување на УЛБ http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online.

Содржина 0 Список на кратенки 7 1 Вовед 9 1.1 Парамиксовируси 9 1.1.1 Класификација 10 1.1.2 Структура 12 1.1.2.1 Вирусни честички 12 1.1.2.2 Геном и структура на геном 12 1.1.2.3 Вирусни протеини 14 1.1.3 Репликација 16 1.1.4 Вируси на параинфлуенца 17 1.1.5 Вирус на заушки 19 1.1.6 Вирус на сипаници 20 1.1.7 Респираторен синцицијален вирус (RSV) 23 1.1.8 Хуман метапневмовирус (hmpv) 25 1.2 Цел на работата 29 2 Материјал и методи 30 2.1 Материјал 30 2.1.1 Опрема 30 2.1.2 Хемикалии 31 2.1 .3 Медиуми 32 2.1.4 Клеточни култури 33 2.1.5 Акциони раствори 33 2.1.6 Бафери 34 2.1.7 Брзи тестови 34 2.1.8 Системи на реагенси 35 2.1.9 Ензими 35 2.1.10 Нуклеотиди 35 2.1.11 Буквари 35 2.1.12 Стандард за ДНК 36 5

2.1.13 Плазмиди 36 2.1.14 Примероци 36 2.2 Методи 37 2.2.1 Клеточна култура 37 2.2.2 Екстракција на РНК од суперинатан клеточна култура со употреба на RNeasy Protect Mini Kit 38 2.2.3 Полимеразна верижна реакција (PCR) 40 2.2.4 Гел електрофореза 45 2.2.5 Прочистување на PCR засилува со употреба на комплет за прочистување QIAquick-PCR 46 2.2.6 Клонирање на PCR засилувачи со помош на комплет за клонирање TOPO TA 47 2.2.7 Секвенционирање на рекомбинантни плазмиди 50 3 Резултати 52 3.1 РНК-подоцнежен тампон 52 3.2 Клеточна култура 53 3.3 Оптимизирање на PCR 53 3.4 инфекции со hmpv и RSV 54 3.5 Распределба на возраста 55 3.6 Сезонски тек 56 3.7 Симптоми и дијагноза 57 3.8 Коинфекции 57 3.9 Случаи 58 3.10 Hmpv и воспаление на средното уво 65 4 Дискусија 67 5 Резиме 71 6 Библиографија 72 7 Признанија 88 6

0 Список на кратенки: АПВ Птичен птивмовирус ЦМВ ЦПЕ ЦРП КТ Цитомегалија Вирус Цитопатичен ефект Ц-реактивен протеин Компјутеризиран томограм ДНК dntps Деоксирибонуклеинска киселина Деоксирибонуклеозид трифосфати Е. Коли Ешерихија коли ЕДТА етилендиамин тетрацетична киселина ецеацетична киселина енеацетацеетична енеацетична киселина енеацетацетична еецетацетична киселина и други FCS фетални телешки серуми GCS Глазгов кома скала HBV HCV HHV hmpv HSV хепатитис Б вирус хепатит Ц вирус хуман херпес вирус хуман метапневмовирус херпес вирус херпес симплекс kb kd Килобази Килодалтон 7

LB mm mrna MRT Luria-Bertani Millimolar messenger-ribonucleic киселина томограм магнетна резонанца ND nm NS не се изведува Нанометар Неструктурен протеин PBS PCR фосфат пуфер солен раствор на полимераза верижна реакција SDS SSPE натриум Додецил сулфат субакутен склерозирачки паненцефалитис микроорганизација RNA rpm

Парамиксовирусите се карактеризираат со следниве пет својства: 1. Тие имаат негативно ориентирана едножична РНК, која се наоѓа исклучиво во РНА-резистентна, спирална нуклеокапсид, која содржи и вирусна полимераза. 2. Транскрипцијата се изведува во типичен режим на запирање-рестартирање. 3. Вирусната репликација се одвива во цитоплазмата. 4. Честичките на вирусот бараат липиден плик на целните клетки со цел да се врзат таму. 5. Вирусот продира во клетката преку фузија на вирусната мембрана со клеточната мембрана (Колинс и сор., 2001) 1.1.1 Класификација Парамиксовирусите се класифицираат во две подфамилии: парамиксо- и пневмовирина. Понатамошната поделба на родови и некои карактеристични претставници е прикажана во Табела 1. 10

Подфамилија на родот човечки животни Paramyxovirinae Respirovirus Параинфлуенцавирус Типови 1 и 3 Говеда Параинфлуенца Вирус Тип 3, Sendaivirus Rubulavirus Mumps Вирус, Параинфлуенцавирус Типови 2 и 4а, б Кучешки Параинфлуенца Вирус Тип 2, Авулавирус castукастел Вирус Вирус Сирус Вирус Сирус Синдром, Морба -Пемилии-преживари-вирус Хенипавирус Хендравирус Нипавирус Хендра Нипах Менангл Пневмовирина Пневмовирус Респираторен говедски синцицијален вирус (РС- респираторен вирус) Синцицијален вирус, пневмонијавирус на глушец Метапневмовивирус хуман ринотрахраеитис вирус хуман вирус на ринус од страна на Меѓународниот комитет за таксономија на вируси во 2000 година 11

2 Материјал и методи 2.1 Материјал 2.1.1 Опрема за инкубатор: инкубатор со гас СО 2, Хераус, Ханау Инкубатор Ц200, Лаботект, електрофореза комори на Мекенхајм: Модел Б1, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Ерланген Модел 41-1825, ПЕКЛАБ Биотехнологија ГмбХ, Ерланген Шитлан: Certomat S, Sartorius BBI Systems International GmbH Rocking Platform, Biometra GmbH, Göttingen Sequencer: 3130 генетски анализатор, применети биосистеми, уреди за напон на Дармштад: напојување модел 500/200, лаборатории за био-рад, напојување од Минхен модел 250/2.5, био-рад лаборатории, Минхен Стерилни клупи: Herasafe, Heraeus инструменти, Ханау STERIL-Антарес, Biohit Deutschland GmbH, Rosbach Thermocycler: Mastercycler градиент, Епендорф, Хамбург Т3 Thermocycler, Biometra GmbH, Гетинген Vortexer: Вител-Genie2, Фишер Научен GmbH, Schwerte Waage: ПМ 1200, Метлер Толдедо ГмбХ, Швајцарија Водена бања: GFL 1038, Гешелшафт за Лаборттехник мбх, Центрифуги со Бургведел: Биопожар 13, Инструменти Хераеус, Ханау Цент rifuge 5415 C/5417 C, Eppendorf AG, Hamburg Megafuge 1.0, Heraeus Instruments, Hanau MULTIFUGE L-R, Heraeus Instruments, Hanau TDX Centrifuge TM, Abbott Diagnostica, Wiesbaden UJ II KS, Heraeus Instruments, Hanau 30

2.1.2 Компании за хемикалии чии хемикалии биле користени: Екстракт од квасец Агароза Ампува Бакто-Агар Бакто-Триптон Бакто Борична киселина Бромофенол Син орел s-минимум Есенцијален медиум ЕДТА етанол етидиум бромид фетално теле серум калиум хлорид калиум хидрофосфат фосфат фосфат хлороводород хлорид хлорид хлороводород хлорид хлорид хлорид хлорид Трипсин/ЕДТА решение SeaPlaque GTG Агароза, Cambrex Bio Science Rockland, Inc.; Biozym Seakem LE Agarose, Biozym, Oldendorf NuSieve GTG Agarose, Biozym, Oldendorf Fresenius Kabi, Bad Homburg Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Merck KGaA, Darmstadt Serva, Heidelberg Biromym, AG KGaA Дармштат Сигма-Олдрих Chemie GmbH, Штајнхајм Биохром, Берлин Мерк KGaA, Дармштад Мерк KGaA, Дармштат Мерк KGaA, Дармштад Мерк KGaA, Дармштат Мерк KGaA, Дармштат Биохром АГ, Берлин 31, Берлин

2.1.3 Media Eagle s Minimal Essent Medium Eagle s-mem-earle NaHCO 3 Додавање на: Глутамин пеницилин Г стрептомицин фетален теле серум Biochrom AG, Берлин 2,2 g/l 280 μg/l 40 U/ml 50 μg/l 10% (v/v) медиум Лурија Бертани (медиум LB) со екстракт од квасец Ампицилин Бакто 2,5 g бакто-триптон 5 g NaCl 2,5 g Aqua dest. 500 ml оваа смеса беше автоклавирана 20 минути, се чуваше во фрижидер на 4 ° C и се додадоа 50 μg ампицилин пред инокулацијата. Плочи на агар Лурија Бертани (плочи на агар ЛБ) со екстракт од ампицилин Бакто квасец 2,5 g Бакто триптон 5 g NaCl 2,5 g Bacto агар 6,25 g дестилирана вода. 500 ml оваа смеса беше автоклавирана 20 минути, откако медиумот се излади, се додадоа 50 µg ампицилин и 20-30 мл се става во сад со петри (Ø: 10 см) и потоа се чува на 4 C во фрижидер. 32

SOC медиум (6 ml) триптон 2% екстракт од квасец 0,5% NaCl 10 mm KCl 2,5 mm MgCl 2 10 mm MgSO 4 10 mm глукоза 20 mm 2.1.4 Клеточни култури Веро-Б4 клетки ATCC-ACC-33 ДОО -МК2 клетки ATCC-CCL7 MS клетки не ATCC наведени MDCK клетки ATCC-CLL-34 RD клетки A-204; ATCC-ACC-250 2.1.5 Акции на раствори ампицилин 50 mg/ml (H 2 O) EDTA (0,5M) EDTA Aqua dest. титриран до pH 8 со NaOH, автоклавиран 186,1 g и 1000 ml етидиум бромид 10 mg/ml 33

Солена вода со фосфат (PBS) NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Aqua dest. pH титрирана до 7,4 со HCl, автоклавирана 8 g 0,2 g 1,44 g 0,24 g и 1000 ml 2,1,6 пуфер Tris-borate-EDTA пуфер (TBE пуфер 5x) Tris-базна борна киселина EDTA ( 0,5 М) H 2 O 54 g 27,5 g 20 ml и 1000 ml 2.1.7 Брзи тестови RSV брз тест Брз тест за грип RSV тест комплет, Directigen, Sparks USA Flu A + B тест комплет, Directigen, Sparks USA Користејќи ги овие брзи тестови секој примерок добиен од пациенти со инфекција на горниот и долниот респираторен тракт беше тестиран за грип и РСВ. Резултатите од овие тестови се вметнати во делот за резултати од оваа работа. 34

8 комплети за реагенси BigDye Терминатор Циклус за секвенционирање циклуси Применети биосистеми, Foster City USA Expand High Fidelity PCR System Roche Diagnostics GmbH, Mannheim HiSpeed ​​Midi Qiagen GmbH, Hilden, HiSpeed ​​Maxi Qiagen GmbH, Hilden, Germany One Step RT-PCR Kit Qiagen Giagen Giagen Giagen Giagen Giagen, Германија QIAprep Spin Miniprep Qiagen GmbH, Хилден, Германија QIAquick-PCR-Кит за прочистување Qiagen GmbH, Хилден, Германија RNeasy Protect Mini Kit Qiagen GmbH, Хилден, Германија Topo-TA Комплет за клонирање Invitrogen GmbH, Карлсруе, Германија 2.1.9 Ензимски ограничувања Биолабс, Швалбах, Германија ДНК полимераза Термус акватикус ДНК полимераза Roche Applied Science, Манхајм, Германија Термус акватикус ДНК полимераза Qiagen GmbH, Хилден, Германија Обратна транскриптаза Омнискрипт, Сенсискрипт Обратна транскриптаза Qiagen GmbH, Хилденатес, Германија 2.1.10 25 nm) деокситимидин трифосфат (25 nm) деоксицитозин трифосфат (25 nm) деоксигванозин патување фосфат (25 nm) Roche Diagnostics GmbH, Манхајм, Германија 2.1.11 Буквари Четирите буквари беа засновани на публикација на Вијазов и сор. (2003) преземена. Нивните низи соодветствуваат на регионот на N генот. 35

Сите прајмери ​​користени за оваа работа се произведени од Сигма, Дејзенховен. Низата што сега следат се забележани во правецот 5 3. 111s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGAG 705as TGCTTTGCTGCCTGTAGATGATGAG 114s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGRGATG 442as GCCATTGTTTTYCTTGCYTC 2.1.12 стандард на ДНК должина 1Kb Plus ДНК-маркер, Манхајм, Manheim, Manheim, Manheim на Универзитетската детска болница Бон од 1 октомври 2001 година до 31 март 2004 година 1 октомври 2001 година 30 септември 2002 година n = 5 (не е вклучено во студијата) 1 октомври 2002 година 31 март 2003 година n = 300 1 октомври 2003 година 31 март 2004 n = 332 n вкупно = 632 36

Низа на цел 1. Раздвојување на влакната со загревање до 95 C 2. Хибридизација со прајмерите со ладење до 54 C 3. Синтеза на ДНК со проширување на букварите на 72 C Циклус на PCR на слика Слика 2 Двојната спирала се стопи во двете единечни жици со загревање до 95 ° С. За да може да се започне синтеза на ДНК, прво треба да се прикачат букварите комплементарни на целната низа. Ова се случува кога реакционата смеса се лади на 54 C. Потоа, почнувајќи од прајмерите, ДНК полимеразата ги синтетизира комплементарните нишки на единечните жици на почетната ДНК. Овој чекор на реакција се одвива на 72 C. Овие чекори се повторуваат неколку пати и количината на ДНК експоненцијално се зголемува. 41

Вгнезден PCR Вгнезден PCR следи класичен PCR. Откако ќе се реплицира поголем дел од ДНК што ја содржи целната ДНК, овој дел се користи како образец за вгнезден PCR, во кој се реплицира помал дел кој исто така ја содржи целната ДНК (види слика 3.2). Оваа постапка овозможува да се зголемат чувствителноста и специфичноста на ПЦР. Во ова дело, за вгнездениот PCR се користеше Roche's Expand High Fidelity PCR систем. Буквар за прв круг Цел на ДНК Буквар за прв круг Вратен буквар за втор круг Прв препис Буквар за втор круг Специфичен амплификат на целната ДНК Слика 3 Вгнезден PCR Горниот дел од сликата покажува PCR (видете погоре). Вториот дел го прикажува вистинското вгнездено PCR. Букварите обележани со буквари од втор круг се оние на вгнездената PCR. Тие се поблиску до целната ДНК од букварите од првиот круг. Специфичните ДНК сегменти исто така се засилуваат тука со употреба на чекори на реакција како што е опишано погоре за PCR. 42

52 Ц 30 секунди издолжување со издолжување 72 С 1 мин По овие циклуси, терминалното издолжување се спроведуваше на 72 С 5 минути. По завршувањето на овој процес, сериите се чуваа на 4 C до понатамошна употреба. Реакционен пристап на вгнезден PCR за hmpv Системот Expand High Fidelity PCR од Рош, Манхајм се користеше за вгнезден PCR. 10-пати PCR пуфер 5 µl dntps (100 mm) 3 μl ензимска мешавина 1 μl 114 буквар (25 pmol/μl) 0,5 μl 442 како прајмер (25 pmol/μl) 0,5 μg MgCl 2 (25 mm) 1 μl RNAse-free вода 34 µl шаблон 5 µl 50 μl протокол на вгнездената PCR По првичната денатурација на 94 ° C за 2 минути, се спроведе следниот циклус 40 пати: 94 ° C 30 секунда денатурација 53 ° 30 секунда закопчување 72 ° 45 секунда издолжување Потоа следеше друг терминал Издолжување на 72 ° C за 5 минути и складирање и во циклусот и во фрижидер на 4 ° C. Серија за разредување за оптимизирање на вгнездениот PCR со додавање на магнезиум За разлика од оној на Вијазов и сор. (2003) предложи протокол за PCR, магнезиум беше додаден во вгнездениот PCR за стабилизација во оваа работа. 44

35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 30,40% 26,70% 28,60% 22% 18% 13. 70% 4,30% 3,60% 3,95% 2002/2003 сезона 2003/2004 сезона вкупно hmpv RSV hmpv + rsv Табела 6 Процентни акции на RSV и hmpv или двојни инфекции од периодот 01.10.2002 до 31.03. 2003 година (сезона 2002/2003), 1 октомври 2003 година до 31 март 2004 година (сезона 2003/2004) и за целиот период (вкупно), врз основа на вкупниот колектив од 300 или 332 пациенти од споменатите периоди. 3.5 Распределба на возраста Возрасната дистрибуција на инфекции со hmpv резултираше во следнава дистрибуција: новороденчиња (возраст од 4 недели) n = 0 (0%), 5 недели-5 месеци n = 16 (14.03%), 6-12 месеци n = 20 ( 17,54%), 13-24 месеци n = 21 (18,42%),> 24 месеци n = 31 (27,19%). Повеќе од половина од инфицирани со hmpv пациенти биле постари од 12 месеци и повеќе од една третина од пациентите биле постари од 24 месеци. Возраста беше непозната кај 26 пациенти (22,8%). Возрасната дистрибуција на податоците е прикажана во Табела 7. 55

22,80% 27,19% 0% 14,03% 18,42% 17,54% до 4 недели 5 недели - 5 месеци 6-12 месеци 13-24 месеци над 24 месеци непозната Табела 7 Процентуална распределба на возраста на пациенти со hmpv -инфекција во периодот од 1 октомври 2002 година до 31 март 2004 година. 3.6 Сезонски тек Сликата прикажана во Табела 8 резултираше во сезонска дистрибуција на инфекции со hmpv. Нема јасна сезонска акумулација за крајот на 2002/2003 година, додека во сезоната 2003/2004 имаше јасен максимум во јануари. 30 25 20 15 10 5 0 hmpv 02/03 hmpv 03/04 октомври ноември декември бер јануари февруари март април табела 8 Сезонски тренд на бројот на случаи со hmpv во зимските периоди 2002/2003 и 2003/2004 56

Аксијална магнетна резонанца со слика 9 B T1 (A), коронален FLAIR (ослабено ослабување на инверзијата со течност) (Б) на 14-месечен пациент со докази за hmpv. Значително зголемување на сигналот кортикални и субкортикални; толкувани како лезии во контекст на енцефалитис (Шилдген и сор. 2005). Обезбедено од Радиолошката клиника на Универзитетот во Бон. Слика 10 КТ слики на ист пациент 2 дена по МНР. Области со хиподенс; толкуван како знак на општ едем на мозокот (пулпа и кортекс). Акумулација на хипердензација во арахноидалниот простор, што сè уште не е видено на МНР (Шилдген и сор. 2005). Обезбедени од Клиниката за радиологија на Универзитетот во Бон 61