PDF 3 Материјал и методи - бесплатно преземање на PDF
Краток опис
1 3 Материјал и методи 3.1 Експериментално поставување, животински материјал, чување и хранење Во две експериментални текови .
Опис
Експериментално поставување, животински материјал, чување и хранење
Влијанието на дигестивниот вискозитет врз морфологијата и хистологијата на тенкото црево на свињите беше испитано во две тест испити. За таа цел, формирана е контролна група и тест група, која се состои од шест свињи. Во текот на првото испитување, се напојуваше полусинтетичка исхрана засновано на изолат од пченкарен скроб и протеин од соја (диета Ц). За да се зголеми вискозноста на дигестивниот систем, 2% од кристалната целулоза беше заменета со високо слаткиот модел на подлогата карбоксиметил целулоза (диета CMC). На вториот тест рок, се храни диета која главно се состои од 'рж и пченица и со тоа содржи природни фактори за зголемување на вискозитетот (диета К). Вискозитетот на дигеста на тест групата (диета Е) се намали со додавање на ензимски препарат кој содржи ксиланаза (храна Zy 68; 480 IU/kg). Табела 1 ги прикажува композициите на различните диети; Табела 2 ги прикажува содржините на хранливите материи и соодветните вискозитети на екстрактите.
Табела 1: Состав на полусинтетички диети C и CMC како и диети базирани на жито K и E.
Компоненти [g/kg uS] пченкарен скроб 'рж пченица соја протеин изолира целулоза, кристален 1 карбоксиметил целулоза 2 гликоза масло од соја монокалциум фосфат сточна вар, газиран премикс3 калиум хидроген карбонат магнезиум оксид лизин метионин треонин триптофан Зи 684
680 134 50 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
680 134 30 20 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
658 200 73 20 19 19 13 12 2.6 1.1 1.1 0.2 -
658 200 73 20 19 13 12 2.6 1.1 1.1 0.2 0.4
1Viva Pur ® тип 200; Работи на пулпа Rettmaier & Sons, Ellwangen-Holzmühlen 2Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Штајнхајм, Германија 3Lohmann Animal Health & Co.KG, Cuxhaven; Содржина по кг: 1,2 милиони IU Vit A; 120 000 IU Vit D3; 4 g Вит Е; 200 мг Вит Б1; 600 мг Вит Б2; 2500 мг ниацин; 400 мг Вит Б6; 4,5 мг Вит Б12; 20 мг биотин; 1800 мг пантотенска киселина; 160 грама натриум; 50 грама магнезиум; 10 грама цинк; 7,5 гр железо; 7,5 гр манган; 150 мг јод; 70 мг кобалт; 40 мг селен 4Lohmann Animal Health & Co. KG, Куксхавен; Zy 68 содржи 1192 IU активност на ксиланаза на g
Материјал и методи Табела 2: Анализирана и пресметана содржина на хранливи материи во полусинтетичките диети C и CMC, како и диетите базирани на жито К и Е.
Сува материја Суров протеин Сурова маст Пепел Сурови влакна NfE NDF ADF Вкупно NSP1 (растворлив)
900,7 115,0 19,9 44,6 (50) 4 671,2 * * *
896,6 116,2 25,3 32,8 (30) 4 692,3 * * *
Арабиноза (растворлива) Ксилоза (растворлива) Маноза (растворлива) Гликоза (растворлива) Галактоза (растворлива) Конвертибилна енергија [MJ/kg uS] 2 Навидум прецизно сварлив суров протеин 3 Вискозитет на екстракт [mPas]
901,9 131,9 32,9 51.3 17,0 668,6 145,9 27,4 103,4 (24,8) 19,4 (4,7) 50,2 (11,8) 4,0 (1,5) 26,0 (5,7) 3,8 (1,1) 13,4
898,9 131,9 31,4 49,7 17,3 668,6 134,6 28,0 102,6 (30,5) 19,1 (4,9) 49,4 (13,0) 2,7 (0,8) 27,8 (9,8) 3,6 (2,0) 13,4
1 утврдени како што е опишано во Бартелт и сор. (2002) 2 пресметана според енергетската содржина на одделните компоненти (DLG, 1991) 3пресметана според содржината и информациите за варење на храната за суров протеин во изолатот на 'рж, пченица и соја во CVB (1996) и Grala et al. (1998) 4 не одговара на содржината на кристална целулоза * во исхраната
24-те тест животни биле свињи од програмата Шауман. Во оваа програма за размножување, производите за вкрстување на расите на германскиот Landrace и Duroc се користат како линија на браната и производи за вкрстување на расите Landrace B и Hampshire како татковска линија. Сите прасиња добиле инекција со железо-декстран на возраст од три дена; мажите биле кастрирани на 15-тиот ден од животот. Шест прасиња беа избрани по случаен избор од две истовремено легло, без оглед на полот, и се одвикнаа на 28-от ден од животот. Шесте постери беа подеднакво поделени помеѓу контролната и тест групата (Ц или ЦМЦ или К или Е). Периодот на хранење траеше три недели во двата тест серија. Свињите биле сместени во индивидуални кутии со подна површина од 1,20 х 1,60 м со целосно ресен под. Имаше визуелен контакт помеѓу соседните кутии. Свињите од различни групи немале директен контакт. 29
Хранењето се одвивало секој ден во 8:00 и 16:00 часот, при што храната слична на брашно се меша со трипати поголема количина вода. Количината на рационалност беше прилагодена на внесот на храна за храна, така што тој беше 100 g првиот ден и просечно 1100 g последниот ден од експериментот. Пред попладневното хранење, кутиите се чистеа со вода секој ден. За тоа време, три кутии од секоја група на храна беа поврзани едни со други. Општата состојба на свињите се проверуваше секој ден. За време на трите недели од експериментот, свињите имале на располагање разни играчки, како што се топчиња, заоблени метални шипки или пластични дискови. Theивотните беа измерени и на почетокот на експериментот, на 28-миот ден од животот, и еден ден пред крајот на експериментот.
потоа се отвора надолжно и на крај се исплакнува трипати во млак физиолошки раствор на натриум хлорид. Цревните делови беа раширени на хартиени крпи за мерење на должината и оставени таму да се исушат околу пет минути. Поединечните делови потоа беа измерени. Сите индивидуални чекори беа извршени од иста личност. Во текот на целата постапка се обрнуваше внимание на особеностите и макроскопски препознатливите патолошки процеси. Тежината и должината на одделните цревни делови во однос на телесната тежина се пресметани во подоцнежен момент од параметрите на тежината и должината на одделните цревни делови. Понатаму, количникот на должина и тежина е забележан како мерка за дебелината на wallидот на тенкото и дебелото црево.
Мерење на вискозитетот на варењето
Отстранетата дигеста се ладеше во мраз веднаш откако беше добиена се додека примероците не беа центрифугирани на 13.000 вртежи во минута (релативно центрифугално забрзување 13600 g) за 10 минути (центрифуга тип 5415 C од Епендорф, Германија). Вискозитетот од 0,5 ml од супернатантот се утврди со помош на вискометар (тип LVDV II; мерна типа на глава Cone вретено CP-40; темпериран до 40,0 ° C, Брукфилд, САД). Доколку беше достапен доволно материјал за примерок, беа извршени двојни мерења. За време на земањето примероци, кај пет животни немало дигеста во илеумот.
За фиксација (20 часа на собна температура) во модифициран раствор на Буин (4% кисела киселина + 2,5% бакар ацетат + 3,5% формол), примероците од ткивото се протегаа на плочи од плута со шила на еж. Потоа беше исплакнат неколку пати со 70% етанол во текот на 24 часа. Подготовките понатаму беа дехидрирани во текот на вкупно 48 часа со помош на серија алкохолни серии (4 пати 2 часа 80%, 30 минути 90%, 2 пати 30 минути 96%, 4 пати 1 час 100% етанол; разјаснување со ксилен I, II и III 20 минути секој пат; секој пат на собна температура). По капењето во мек парафин со точка на топење од 46 ° C, примероците беа вградени во тврд парафин на 60 ° C (точка на топење 57 ° C).
Примероци од ткиво со големина од околу 1,5 см2, истегнати на плочи од плута, беа фиксирани 24 часа во следниот раствор: 2% параформалдехид + 2,5% глутаралдехид во 0,1 М какодилат пуфер, pH 7,2. Потоа, тие беа исплакнат неколку пати со пуферот за плакнење споменат во Поглавје 3.4.2 и беа фиксирани со соодветниот раствор на темиксид на осмиум 2 часа на собна температура. По повторено испирање, примероците се мијат преку растечка серија алкохоли (2 пати 30 минути 50 и 70%; 30 минути 80% етанол I, 16 часа 80% етанол II, 2 пати 30 минути 90 и 96% и 4 пати 30 минути 100 % етанол; секој на 4 ° C) дехидриран. Потоа следуваше 2-часовен третман со HMDS (1-1-1-3-3-3 хексаметилдисилазан; Рот 3840,2) на собна температура пред да испарат препаратите преку ноќ (собна температура). Откако ќе се залепат препаратите за примероци на плочи со употреба на спроводен калај (Плано), тие се чуваат во вакуумски кабинет сè додека не се распрсне (една минута; Sputter Coater S150B, Edwards Company, Англија).
Преглед на боење, како и доказ за пролиферација и апоптоза за светлосна микроскопија
За морфолошките и морфометриските истражувања, делови со дебелина од 5 μm беа обоени со хематоксилин-еозин (HE). Покрај тоа, делови со иста дебелина се обоени со периодична киселина Schiff реагенс Alzian blue (PAS-AB), pH 2,5. Боите што се користат овде, различно ги обојуваат мукозните супстанции (муцини) во клетките на пехарот, во зависност од нивната pH вредност. Од една страна, ова во голема мера го поедноставува откривањето на ќелијата со пехар, од друга страна, киселите муцини се прикажани во сина боја, додека неутралните муцини се прикажани со црвена боја (Ромеис, 1989). Понатамошна диференцијација на муцините не беше направена. За да се утврди стапката на пролиферација и апоптоза, беа извршени посебни верификации, кои се опишани индивидуално подолу.
Откривање на активни клетки на пролиферација
Принцип на методот на откривање Аналогниот тимидин бромодеоксиуридин (BrdU) беше администриран интраперитонеално кај свињите ante mortem еден час во концентрација од 15 mg/kg жива тежина. Во текот на овој час, модифицираниот уридин бил вметнат во нивниот генетски материјал од клетките во S фазата на клеточниот циклус. Вградените brdUridines се означени со моноклонални антитела од глушец. Врзаните примарни антитела се видливи со методот на пероксидаза-анти-пероксидаза (PAP), имуноглобулин од зајак кој служи како антитело за премостување (Ромеис, 1989). Јадрата што содржат BrdU се појавуваат кафеави. Реагенсите користени за ова беа како што следува: СИЛАНИ: Слајдовите беа обложени според упатствата на Sigma A3648. ТБС I: пуфер за миење I (солен раствор на пуфер во ТРИС); 0,1 М TRIS + 0,1 М NaCl + 0,05 М MgCl; pH 7,5 пуфер за инкубација: 0,05 M TRIS + 0,9% NaCl + 0,66 mM MgCl2 + 1% BSA + 0,1% желатин (Merck 4078) TBS II: пуфер за миење II; 0,05 М ТРИС + 0,9% NaCl; pH 7,6 трипсин: 0,1% + 0,1% CaCl2 во TBS I (pH 7,6-7,8) SwNS: нормален серумски свињи (DAKO X 0901); за преинкубација 20% во реагенси за откривање TBS I (инкубација): Инкубација I: MaBrdU (DAKO M 07444; глувче моноклонално антитело против BrdU); 1:25 во тампон за инкубација + 2% SwNS 33
Инкубација II: RaMIg (DAKO Z 0259; антитела на зајак против имуноглобулини на глувчето); 1:40 во тампон за инкубација + 2% SwNS инкубација III: глувче PAP (DAKO B 0650); 1: 250 во тампон за инкубација + 2% SwNS BSA:
говедски серумски албумин (Рот 8076,2)
Принципи на методите за откривање За време на апоптозата, карактеристичните ДНК фрагменти произлегуваат од активноста на сопствените ендонуклеази на клетката. Една можност за хистолошко откривање на овие фрагменти е можноста на Гавриели и сор. (1992) го опиша методот на ТУНЕЛ (терминално обележување на крајот на никот на деоксинуклеотидил трансфераза (TdT) dUTP-биотин). Се базира на специфичното врзување на ензимскиот терминален деоксинуклеотидил трансфераза (TdT) со 3'-OH краевите на ДНК. Овој ензим ги спојува биотинските етикетирани деоксиуридин трифосфати (биотин-dUTP) до краевите на ДНК-фрагментот. Биотинот на крајот се прави видлив според ПАП-методот. Страптавидин-биотин комплексот што се користи овде, со кој пероксидазите се хемиски споени, ги заменува антителата (Гаврили и сор., 1992). Во друг метод, откриено е присуство на ензим типичен за апоптоза, каспаза-3. Ензимите во цитоплазмата се обележани со помош на специфично антитело од зајак. Примарните антитела се видливи со користење на веќе споменатиот метод ПАП. Антителото мост што се користи во овој случај потекнува од коза.
Реагенсите користени за тунелот беа како што следува: TBS: 0,05 M TRIS-HCl (рН 7,6) + 0,9% NaCl TdT пуфер: 30 mM TRIS + 140 mM Na какодилат + 1 mM CoCl2; pH 7,2 ТБ пуфер: 0,3 М NaCl + 0,03 М Na цитрат; pH 8,0 Biotin-dUTP: Boehringer 1093 070, оригинален раствор (50 nM/50 μl) разреден 1:10 со PBS; користен раствор 5 nM/50 μl (складиран во делови на -20 ° C) TdT:
Боерингер 220 582, тимус на теле; Оригинален раствор (500 U/20 μl) разреден 1:25 со 50% глицерол во PBS; користен раствор 500 U/500 μl (се чува во делови на -20 ° C)
Говедски серумски албумин (Рот 8076,2; чување на 4 ° C)
SABC-KIT: Комплекс на стрептавидин-биотин (DAKO K0377; складирање на 4 ° C) DAB: 37,5 mg диаминобензидин/150 ml TBS + 70 μl H2O2 30% протеин киназа; ФЛУКА 82456; 5, 10, 15, 20, 50 или 100 µl/ml TBS DNAse: 0,5 U/μl (Boehringer Mannheim, 776785) Постапка Парафинските делови со дебелина од 3 µm беа нацртани на соодветни слајдови и се натопија за откривање на пролиферација. Подготовките потоа беа обелени во метанол со 0,3% водород пероксид (30 минути) и потоа се исплакнаа со двојно дестилирана вода. За 35-ти
За откривање на каспаза-3 се користени следниве реагенси: пуфер од цитрат: 0,01 М; pH 6,0 PBS: солен раствор на фосфат; без јони на Ca и Mg; pH 7,4 БСА: говеден серумски албумин (ROTH 8076,2; чување на 4 ° C) NSfS: нормален овчо серум (DAKO X0503; складирање на 4 ° C) ЦНС: зајачки нормален серум од коза (DAKO X0907; складирање на 4 ° C) -Серум: ДАКО X0902; Складирање на 4 ° C DAB: 20 mg диаминобензидин/100 ml PBS + 25 μl H2O2, 30%; pH 7,6 Користени антитела: RahCaspase-3: Serotec AHP476 (антитело на зајак против човечка каспаза-3); 1: 100 во PBS + 2,5% CNS + 0,1% BSA (складирање на 4 ° C) GaR-Ig: DAKO Z0421 (антитела на коза против имуноглобулини на зајак); 1:20 во PBS + 1% BSA (складирање на 4 ° C) Зајак-PAP: DAKO Z113; 1:40 во PBS + 1% BSA (складирање на 4 ° C)
Светло и електронски микроскопски преглед
Лесните микроскопски прегледи беа извршени со помош на аксиоскоп од Зејс, Германија. При испитувањето на секциите обоени со HE, особено внимание се посвети на обликот на ресичките, текот на криптата и индикациите за појава на апоптоза. Деловите обоени со PAS-AB (pH2.5) беа оценети во однос на распределбата на пехарските клетки и pH-вредностите на муцинот што се случуваат. Пред да се проценат примероците врз кои биле извршени специфичните докази (пролиферација и апоптоза), специфичноста на методот прво била проверена со употреба на позитивни или негативни контроли. Последователно, особено внимание беше посветено на појавата и локацијата на конструкциите што треба да се детектираат. Испитувањето на електронскиот микроскоп за скенирање е извршено на уред од Бауш и Ломб, Канада, тип Нанолаб 2000. Евалуацијата на микроскопските примероци на транселектрон е извршена на ЕМ 10 CR уред од Зејс, Германија.
конечно беше изразена во бројот на пролиферации по мм од обемот на криптата. Покрај тоа, вкупната количина на активни поделби на епителните клетки во одреден дел од мукозната мембрана е пресметана со множење на релативната стапка на пролиферација со соодветниот фактор на зголемување на површината на мукозната мембрана предизвикана од формирање крипта. Резултирачката вредност изразува колку пролиферации се присутни во епителот на криптата во одредена должина на ламината мускулна мукоза. Конечно, беше пресметан индексот на обновување на епителот. За таа цел, беше поставена вкупната количина на активно делење на епителните клетки во однос на големината на површината на ресичките. Индексот на обновување покажува колку нови епителни клетки се појавуваат во однос на површината на ресичката [пролиферација/мм површина на ресички].
Сите параметри беа утврдени на секоја свиња и во сите три дела на цревата. Во одделни случаи, земените примероци беа неупотребливи. Средната вредност е формирана од вредностите на истиот параметар, кои биле евидентирани неколку пати за секое животно и за секој дел. Да ги сумираме шесте свињи во група, беше утврдена и аритметичката средина. Споредбите на индивидуалните параметри помеѓу групите беа извршени со двофакторна анализа на варијанса. Нивото на значење беше 0,05. За да се земат предвид ефектите на легло, факторот „ѓубре“ беше вгнезден во факторот „Група“. Потоа, со стандардизираните остатоци беше извршен тест за соодветност на Колмогоров-Смирнов со цел да се провери постоењето на нормална дистрибуција. Може да се претпостави нормална дистрибуција за сите параметри. Со цел да се испитаат разликите во параметрите помеѓу одделните делови на тенкото црево, прво беа просечни вредностите на сите свињи. Потоа беше извршен т-тест за спарени примероци, а нивото на значење беше исто така 0,05. Анализите беа извршени со помош на компјутерската програма SPSS за Windows, 9.0.1, 1999 година.