Подготовка на протокол за квалитетни инозитол пирофосфати (превод на германски)

Резиме

Инозитол пирофосфатите играат важна улога во човечките болести како што се рак, дијабетес и дебелина, сепак точниот механизам на дејствување е контроверзен. Недостатокот на комерцијално достапни инозитол пирофосфати ги прави проблематични деталните студии. Овде опишуваме едноставен протокол за производство и изолација на милиграми инозитол пирофосфат.

Апстракт

Мио-инозитол се јавува природно или непроменет или во посложени фосфорилирани деривати. Од најновите, двете најчести во еукариотските клетки се инозитол пентакисфосфат (ИП 5) и инозитол хексакисфосфат (фитинска киселина или ИП 6). IP 5 и IP 6 се претходници на инозитол пирофосфатни молекули кои содржат една или повеќе пирофосфатни врски 1. Фосфорилацијата на IP 6 произведува дифошоинозитол пентакисфосфат (IP 7 или PP-IP 5) и бисдифошооинозитол тетракисфосфат (IP 8 или (PP) 2-IP 4). Инозитол пирофосфатите се изолирани од сите еукариотски организми досега е проучен. Покрај тоа, двете различни класи на ензими одговорни за синтезата на инозитол пирофосфат се многу зачувани за време на еволуцијата 2-4.

IP 6 киназите (IP 6 Ks) имаат огромна каталитичка флексибилност, претворајќи ги IP 5 и IP 6 во PP-IP 4 и IP 7 или потоа со користење на овие производи како подлоги, промовирајќи генерирање на комплексни молекули 5, 6. Неодамна, идентификувана е втора класа на ензими кои произведуваат пирофосфат во форма на протеин од квасец ВИП 1 (познат и како ПП-ИП 5К), кој е во состојба да претвори IP 6 во IP 7 и IP 8 7,8.

Инозитол пирофосфатите регулираат многу различни клеточни процеси како што се лачење на инсулин 9, должина на теломер 10,11, хемотакса 12, везикуларна трговија со 13, фосфатна хомеостаза 14 и ослободување на замокот ХИВ-1. Два механизма на дејствување се предложени за оваа класа на молекули. Тие можат алостерично да влијаат на клеточната функција преку интеракција со одредени протеини како што е АКТ 16. Алтернативно, групата пирофосфат може да донира фосфат на фосфорилирани протеини 17. Огромниот потенцијал на оваа област на истражување е отежнат од недостаток на комерцијален извор на инозитол пирофосфат, што спречува многу научници да ги проучуваат овие молекули и оваа нова пост-преведувачка модификација. Тековните достапни методи за изолација на инозитол пирофосфатите бараат софистициран хроматографски апарат 18,19. Овие процедури ги искористуваат киселите услови што можат да доведат до распаѓање на инозитол пирофосфат, а со тоа и на слабо закрепнување. Исто така, незгодните процедури за десолирање по колоната ја ограничуваат нивната употреба во специјализирани лаборатории.

Во оваа студија опишуваме баран метод за генерирање, изолација и прочистување на производите на реакциите на ИП 6-киназа и ПП-ИП 5-киназа. Овој метод е овозможен со можноста на електрофорезата со гел од полиакриламид (PAGE) да раствора високофосфорилиран инозитол полифосфат 20. По ензимски реакции на IP 6 K1 и PP-IP 5 K со употреба на IP 6 како подлога, се користеше PAGE за раздвојување на генерираните инозитол пирофосфати, кои последователно се елуираа во вода.

Протокол

1. Ензимска реакција - ден 1 (1 час попладне)

  1. Првиот чекор е да се подготват 10-20 независни ензимски реакции во кои IP 6 K1 или VIP1 го претвораат IP 6, пирофосфорилираните изоформи.
  2. Ние користиме His-IP 6 K1 и GST-VIP1 ензими прочистени од E. coli според протоколот претходно опишан 17,18.
  3. Подгответе 50 μl реакции со 1x тампон на реакција (30 mM Хепис pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM фосфокреатин (PCr), 25 U/mL креатин ФосфоКиназа (CPK), 5 mM ATP (Mg сол), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 μg His-IP 6 K1 или GST-VIP1. Прилагодување на јачината на звукот со MiliQ ddH 2 O.
  4. Накратко вртете ја реакцијата и на 37 ° C преку ноќ со ротација.

2. Истурање и полнење на гел со полиакриламид - ден 2 (4 часа попладне)

  1. Гелот полиакриламид се прави со употреба на стаклени плочи долги 24 см, ширина од 18 см и ширини ширина од 1,5 мм. Обично се користи 16 ленти или подготвителен чешел со една лента.
  2. Подгответе смеса (50 ml/гел) со следнава содржина: 35,5% (без напон) акриламид: бисакриламид 19: 1, 1X трис/борат/ЕДТА (ТБЕ), 0,05% (без напон) амониум персулфат (APS), TEMED 0,05% (w/v). Истурете ја смесата помеѓу претходно леаните стаклени плочи, вметнете го чешел и оставете да се полимеризира 30-60 минути на РТ.
  3. Откако ќе се полимеризира гелот, пренесете ги уредите во фрижидер и во 1X ТБЕ околу 30-60 минути на напојување од 200-300 волти.
  4. На секоја реакција додадете 1X боја на OrangeG (10mM Tris-HCl pH 7,0, 1mM EDTA, 30% глицерин, 0,1% OrangeG). Подгответе примерок со 2 nmol IP 6 како стандардно контролно оптоварување.
  5. Измијте го секој добро темелно со пуфер што работи, користејќи шприц и игла 21G за да се отстрани талогот, а потоа ставете го гелот. Избегнувајте вчитување на страната на бунарот.
  6. Стартувајте го гелот преку ноќ на 450-550 волти (7 МАМП/гел) додека лентата за боја на OrangeG не се наоѓа на последните 10 см од дното на гелот.

3. Изолација на IP 7 - ден 3 (4 часа) и ден 4 (6-7 часа SpeedVac сушење)

  1. Расклопете го апаратот за гел и внимателно отстранете ја едната стаклена плоча оставајќи го гелот врз другата. Исечете мал дел од гелот веднаш над лентата за боја на OrangeG на дното користејќи го IP-6 стандардот и трага од примерок како во илустрација 1 прикажано.
  2. Обојте го исечениот дел од гелот со толуидин сина боја (0,1% (w/v) толуидин сина, 20% (w/v) метанол, 2% (w/v) глицерин) неколку минути (1-3 мин) или повеќе се појавува лентата со инозитол пирофосфат. Ставете ја стаклената плоча повторно на врвот на гелот претходно за да спречите сушење на необоениот гел.

Опсегот IP-7 треба да биде видлив бидејќи работи малку побавно од стандардот IP-6. АТП работи побрзо од IP 6 исто така треба да биде видлив (Илустрација 1). Пренесете го обоениот дел од гелот во раствор за боење (20% (w/v) метанол) неколку минути, измијте го вишокот на толуидин сина боја и поставете го гелот со необоен гел.

Доколку е потребна визуелизација на повисоките пирофосфорилирани изоиформни инозитоли (ИП 8 и ИП 9), обојте го гелот со раствор за боење на толуидин сино 20 минути на собна температура. Потоа измијте ја толуидинската сина боја со раствор за де-боење околу 15 минути.

4. Одредување на концентрацијата и чистотата на IP 7.

  1. Користете 2-5 μl од обновениот примерок IP 7 на PAGE гел, сличен на деловите 2.2-2.5. Ставете повеќе разредувања на IP 6 (т.е. 0,5, 1, 2, 4 nmol) како стандарден концентрација и 4 nmol поли-P маркери. Откако ќе го стартувате гелот, визуелизирајте ги изофомрите на инозитол пирофосфат со боење и де-боење на целиот гел со толуидин сино решение, во согласност со постапката од Дел 3.2. (Слика 2А) опишани.
  2. По боење со толуидин, концентрациите може да се одредат со скенирање на гелот и споредување на разликите во интензитетот помеѓу IP 6 и IP 7, со користење на софтвер за слики како што се: Б. Слика-Ј, како во Слика 2B прикажано.

5. Репрезентативни резултати:

Подготвителната ензимска конверзија на IP 6 во 7 преку IP IP 6 K1 и VIP1 ензимите лесно може да се поправи со PAGE анализа (Илустрација 1). Вчитувањето на ИП 6 како контрола на големината заедно со боењето на толуидин синиот гел овозможува идентификување на пирофосфорилираните деривати бидејќи тие работат побавно, во зависност од бројот на фосфатни групи на инозитолниот прстен. Методот опишан погоре овозможува едноставно прочистување на IP 7. Анализата на прочистениот инозитол пирофосфат со PAGE покажа чистота на нашата IP 7 (Слика 2А). Интересно е што 1/3PP-IP 5 изомерот на производот IP1 VIP1 мигрира нешто побавно од 5PP-IP 5 изомерот на IP 7 генериран од IP 6 K1. Употребата на ИП 6 стандардите овозможуваат лесна квантификација на концентрацијата на прочистениот ИП 7 (Слика 2Б). Пред да се користи IP 7 за понатамошни експерименти, може да се процени неговата биолошка активност
(Слика 3). 5PP-IP 5 се инкубира со VIP1 и со IP 7 фосфатазата DDP1 (дифосфоинозитол полифосфат фосфохидролаза). Исчистените IP 7 до IP 8 на VIP1 и IP 6 на DDP1 рутински се чистат (Слика 3) преобратен.

квалитетни
Илустрација 1:. Боење со толуидин со PAGE и изолација на IP 7-Band-Der Дел од гелот со стандардниот (IP 6) беше исечен и обоен со раствор на толуидин сина боја. Трите опсези претставуваат (од горе до долу) IP 7, IP 6 и ATP. Обоениот дел од гелот потоа беше порамнет со остатокот од гелот. Ова овозможува локализација на делот од гелот со IP 7, кој потоа се сече и се чисти (испрекината кутија).

подготовка
Слика 2: Анализа на страницата на производи за реакција на IP 6 K1 и VIP1. А) Користена е анализа на IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) со боење на толуидин сино за да се утврди концентрацијата на IP 7 и на IP 6 K1 (5PP-IP 5) и на VIP1 (прочистена 1/3PP-IP 5) ) Реакции. Б) Анализа на дијаграм за расфрлање за да се одреди концентрацијата на прочистената IP 7. Концентрациите се утврдени според интензитетот на опсегот, пресметан со софтверот ImageJ, во споредба со претходно утврдените количини на IP 6. X-оската претставува интензитет, Y-оската претставува концентрации изразени во nmol.

подготовка
Слика 3: Анализа на биолошката активност на IP 7 Со цел да се утврди квалитетот на прочистениот IP 7, ние инкубиравме 5PP-IP 5 (IP 6 K1 генериран IP 7) со VIP1 или со IP 7 фосфатазата DDP1 и потоа решивме да реагираме на PAGE. Боењето на DAPI и Толуидин го покажа очекуваното производство на IP 8 од VIP1 и претворање на IP 7 во IP 6 од DDP1.

Дискусија

Употребата на инозитол пирофосфат во биохемијата е строго ограничена од комерцијалната недостапност на ваквите соединенија и ниската чувствителност на постојните методи на откривање. Комбинација на PAGE, што овозможува раздвојување на молекулите кои имаат различен број на фосфатни групи и толуидин сина (Илустрација 1), Метахроматска боја што ги врзува фосфатните групи овозможува лесно откривање на изоформи на инозитол пирофосат, отворајќи нови патишта во истражувањето 20.

Опишаната употреба на PAGE технологија во инозитол пирофосфат за прочистување на производите од ензимската реакција спроведена преку IP 6 K1 или VIP1 е едноставен, економичен и сигурен метод што овозможува производство на големи количини на високо квалитетен IP 7. Методот опишан погоре не е ограничен на едноставното прочистување на IP 7, но ситни помали модификации на опишаниот протокол може да дозволат прочистување на различен опсег на инозитол пирофосфат. Повисоки фосфорилирани изофори на инозитол пирофосфат, со повеќе од осум фосфатни групи, може да бидат повеќе забележливи со IP 7 или различни количини на IP 6 отколку супстратот 20,6. Овој инозитол пирофосфат може да се открие со зголемување на должината на бојата и потоа прочистен (Дел 3.2). Дополнително, употребата на IP 5 како супстрат за ензимската реакција ќе овозможи прочистување на PP-IP 5 и други инозитол пирофосфати со хидроксилна група на инозитол прстен.

Како резултат, овој метод кој не бара барање овозможува сигурно чистење на милиграм количини на инозитол пирофосфат со широко достапни инструменти и со тоа се отвораат нови патишта за ова возбудливо поле на истражување.

Откривање

Не е прогласен конфликт на интереси.

Признанија

Му благодариме на А. Ричио за корисни коментари и за читањето на ракописот. Оваа работа беше поддржана од финансирање на Советот за медицински истражувања (МРЦ) на Единицата за биологија на клетките и од грант за програма за наука за човечки граници (RGP0048/2009-C).