Производство на инсулин
Дијабетесот е болест број еден на цивилизацијата. Во типот I, островите Лангерханс се уништени од имунолошкиот систем. Овој тип се јавува пред 20-та година од животот. Кај тип II (дијабетес кај возрасни), кој се јавува кај повеќето дијабетичари, има нормално или зголемено ниво на инсулин во крвта, но промените во местото каде што работи хормонот ќе ја намалат неговата функционалност.
Потребата од инсулин е исклучително голема. Благодарение на употребата на генетски модифицирани бактерии, денес е полесно да се покрие отколку порано. Пред да се користат бактерии, инсулин се добиваше од панкреасот на свињи или говеда. Дијабетичар користел панкреаза од околу 50 свињи за да ги покрие своите годишни потреби.
Што е проблемот?
Објаснува кои клеточни-внатрешни процеси се случуваат во бета-клетките што доведуваат до активен инсулин.
Како може да се произведе хуман инсулин со помош на бактерии.
Инсулин - производство кај луѓето
Инсулинот е многу мал хормон составен од два синџири аминокиселини (синџири А и Б). Синџирот А се состои од 21 аминокиселина, синџирот Б од 30 аминокиселини.
Двата синџири најпрво се синтетизираат како дел од синџирот 110 АА. Оваа долга форма е препроинсулин.
24 аминокиселини на овој претходник ја сигнализираат ендоплазматската мрежа за да ја зафати. Оваа низа на сигнал е поделена за време на снимањето.
Останатите 86 аминокиселини го формираат проинсулин (синџири А, Б и Ц). Синџирите А и Б комуницираат преку дисулфидни мостови (-S-S-).
Ц-ланецот (Ц-пептид) потоа се одделува ензимски.
Ц-пептидот обезбедува просторно правилно усогласување на синџирите А и Б (формирање на дисулфидни мостови); ова е единствениот начин за функционирање на инсулинот.
Модификацијата на претходникот на протеинот за време или по преводот е позната како обработка на протеини.
Како да направите хуман инсулин со E. coli
Чекор 1
Модифицираната проинсулин mRNA е изолирана и синтетизирана со реверзна транскриптаза за да се формира RNA-DNA хибрид.
чекор 2
Единствената нишка на ДНК се комплетира со помош на ДНК полимераза. ЦДНК е подготвена.
чекор 3
Почетниот кодон е ензимски прикачен на инсулинската ЦДНК (А.: TAC за AUG → метионин, започнете со кодон) како и „лепливи краеви“ (Б.: лепливи краеви) додадени.
Резултат
Така, готовата „патничка ДНК“ се состои од „лепливи краеви“, почетниот кодон и проинсулинскиот ген за синџирите Б, Ц и А.
Рекомбинирајте - вметнете во векторот
Странската ДНК добиена на овој начин сега е инкорпорирана во векторот pBR322. Векторот содржи ген за бета-галактозидаза и ген за отпорност на ампицилин.
Чекор 1
Со сечење со Eco RI, странската ДНК треба да се вгради во средината на генот за галактозидаза.
чекор 2
Се создаваат „лепливи“ краеви кои се комплементарни на странската ДНК.
чекор 3
Интеракцијата на „лепливите“ краеви ја вметнува странската ДНК во плазмидот.
Чекор 4
Празнините се затвораат со ДНК лигази. Рекомбинираниот плазмид е подготвен.
Важноста на оперонот за експресија на гени
Со инкорпорирање на генот проинсулин во генот галактозидаза, лак-оперонот може да се користи за изразување на гени. Во исто време, галактозидазата протеин ја штити инсулинската компонента од сопствените ензими на клетката, протеазите, кои првенствено ги распаѓаат помалите протеини веднаш.
Современите методи го користат генот на триптофан синтаза за да го земат генот на проинсулин, кој е контролиран од ензимска репресија. Типтофан оперон исто така содржи механизам кој ја зголемува експресијата на генот во случај на недостаток на триптофан, што може да се користи технички добро.
Трансформирај - Избери - Клон
Плазмидите се воведуваат во E. coli со трансформација. Отпорност на ампицилин се користи за избор. Рекомбинираните бактерии се размножуваат во ферментатори.
Од безбедносни причини, инсулинските ланци А и Б беа изразени одделно во два различни сорта на E. coli во подолг временски период со цел да се исклучи можноста бактериите да синтетизираат хуман инсулин. Бактериите опремени на овој начин би предизвикале шеќерен шок доколку влезат во нашите црева.
Експрес - Измени
Експресијата на генот е активирана со додавање на лактоза. Се изразува генот бета-галактозидаза со вграден ген на инсулин. Се создава фузивен протеин на галактозидаза и проинсулин.
Генскиот производ е изолиран од хранливиот медиум со центрифугирање. Со цијаноген бромид, бета-галактозидазата дел се одделува од проинсулин со уништување на аминокиселината метионин вграден во него.
Проинсулинот се модифицира во инсулин со ензимот трипсин. Бидејќи бактериите го немаат потребниот ензим, тој треба да се додаде по чистењето.
Производство на интерферон од бактерии
Важноста на експресијата на човечките гени во клетките домаќини (бактерии, квасци) е исто така јасно од следниот пример на интерферон. Како активна состојка во третманот на рак или мултиплекс склероза, таа беше достапна само за неколку луѓе пред да се произведе со генетски модифицирани бактерии. Дотогаш, интерферонот се добиваше од крвни клетки. За 400 мг интерферон беа потребни 50 000 литри крв. Денес може да се произведе во која било количина со употреба на рекомбинирани клетки на E. coli.