Разликување на функционалните улоги на експресијата на гените од имуните и неимуните клетки во глувчето

Резиме

Трансплантацијата на коскена срцевина нуди начин за промена на генотипот на клетки добиени од коскена срцевина. Ако генот на интерес е изразен и на клетките добиени од коскена срцевина и на клетките кои не се добиени од коскена срцевина, трансплантацијата на коскена срцевина може да ги смени клетките добиени од коскена срцевина во различен генотип без генотип на клетките кои не се добиени од коскена срцевина.

Апстракт

Протокол

А. Пред да започнете со технички размислувања

* Краток опис на протоколот за тест е во илустрација 1 прикажано.

2. Зрачење на глувци приемници

Глувците се одгледуваат и се чуваат во патоген уред. Ставете глувци во автоклавна пита за зрачење со филтри. Ставете глушец во секој слот од питата за зрачење. Ставете ја тортата во центарот на вниманието и проверете дали вртливата плоча и тортата се вртат.
Вклучете ја пумпата за воздух за вентилација. Затворете ја вратата на грејачот и заклучете ја.
Зрачете ги глувците со 1000 рад (што е еквивалентно на 10 Gy) околу 10 мин (во зависност од изворот на зрачење и полуживотот). Во овој момент, озрачените глувци се имунокомпромитирани, а имунитетот кон инфекцијата е слаб. По зрачењето, извадете ја тортата и ставете ја во стерилен сад за транспорт до кабинетот за биосигурност на животните. Избегнувајте давање глувци на надворешно опкружување за да ја минимизирате можноста за инфекција.
Во кабинетот за биосигурност, префрлете ги глувците во автоклави кафези со автоклави кревети (4 глувци на кафез. Нова стерилна вода со суспензија на сулфатрим - 3,12 ml на 100 ml вода).
Завиткајте го шишето со вода со алуминиумска фолија бидејќи антибиотиците се чувствителни на светлина. Протресете го шишето со сулфатрим добро измешајте го пред да го ставите во кафез.

3. Екстракција на донаторна коскена срцевина

4. Броење на клетки на донатори на коскена срцевина

Додадете 100 μl трипан сино во Епендорф цевка и 100 μl суспензија на коскена срцевина во Епендорф цевка и измешајте. Пипетете ја мешавината од обоените клетки на комората за броење.
Количината на клетките се пресметува од вкупната површина на живеење на бројот на клетките на коскената срцевина во цевката Сокол = небоен клеточен број во 16 квадрати x 2 (поради разредување на синиот трипан) x 10,000 x 50 ml
Центрифугирајте ги клетките на коскената срцевина во 50 ml цевки со сокол на 2.000 вртежи во минута за 5 мин на 4 ° C.
Отстранете го супернатантот. Врз основа на вкупниот број на клетки, променете ја големината на топчето со PBS на 1 x 10 8 клетки на ml

5. Инфузија на глувци примачи

Загрејте ги глувците примачи на грејната подлога и под ламба за греење. Ставете ги глувците примачи во прицврстувач. 1 × 10 7 клетки по глувче во 100-200 μl интравенски.
Инјекцијата на донаторската коскена срцевина мора да се изврши помеѓу 4-24 часа по зрачењето.
Држете се на 4 инјектирани глувци по кафез. Инјектираните глувци примачи одржувајте ги во автоклавирани кафези со вода третирана со антибиотици во првите 4 недели во одгледување на животни без патогени и оставете ги глувците да го повратат имунитетот. Променете кафези, вода и храна третирана со антибиотици на секои 4 дена за да ја одржите хигиената.

6. Индукција на колитис и проценка на колитис

7. Инспекција на квалитет на трансплантација на коскена срцевина со употреба на проточна цитометрија

Етикета на секоја цевка од примерок во крвта или коскената срцевина # 1-5:
Подгответе ја мешавината на антитела за секоја соодветна цевка во мракот.

# 1 Без антитела
# 2 Контрола на изотип на FITC од 30 μl + Контрола на изотип на PE од 30 μl + блокирање на 15 μl ЦД16/32
# 3 блокирање на 30 μl FITC CD45.1 Ab + 15 μl ЦД16/32
# 4 блокирање на 30 μl PECD45.2 Ab + 15 μl CD16/32
# 5 30 μl блокирање на FITC CD45.1 Ab + 30 μl PE CD45.2 Ab + 15 μl ЦД16/32

Не додавајте ништо на примерокот од крв или коскена срцевина # 1

Додадете 5 μl мешавина на антитела # 2 на секој примерок од крв или коскена срцевина # 2

Додадете 3 μl мешавина на антитела # 3 на секој примерок од крв или коскена срцевина # 3

Додадете 3 μl мешавина на антитела # 4 на секој примерок од крв или коскена срцевина # 4

Додадете 5 μl мешавина на антитела # 5 на секој примерок од крв или коскена срцевина # 5

Чувајте во мрак во мраз 30 мин.
2 ml пуфер за лиза на 1X RBC во секоја цевка. Чувајте во темница на мраз 15 мин.
Центрифугирајте ги ќелиите на 1500 вртежи во минута, 5 мин на 4 ° C. (GH 3,8 ротор, 1500 вртежи во минута = 350 xg) Извадете го супернантот. Пелетот со 500 μl тампон за боење на клетки во мракот, а потоа насипете на кратко.
Проверете ги CD45.1 (еквивалентно на WT) и CD45.2 (на KO) во примероците со имунитет на крв и коскена срцевина користејќи проточна цитометрија. Изберете FITC за да го претставува WT CD45.1 и PE го претставува KO CD45.2.
Анализирајте ги резултатите од протокот на цитометријата со помош на софтверот FlowJo. Пресметајте го односот на односот FITC: PE или PE: FITC соодносот за да утврдите дали донантни генотипови на генотипот на донаторот во крвта и коскената срцевина.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Ако генот на интерес игра значајна улога во имуните клетки во развој на колитис, глувците кои примаат коскена срцевина од различен генотип преку трансплантација на коскена срцевина (WT KO или KO до WT) треба да имаат изменет одговор на DSS колитис. Еден од најважните параметри при утврдување на сериозноста на колитисот е H & E боење на ткивата на дебелото црево. Промените во структурата на ткивата на дебелото црево и знаците на воспаление може да се проценат квантитативно со системот за оценување на хистологијата H&E. Критериумите за оценување на хистологијата H&E за моделот DSS колитис може да се најдат овде 2. Алтернативно, хемиски индуциран колитис, исто така, може да биде предизвикан од тринитробензенсулфонска киселина (TNBS). Методи на индукција на TNBS колитис и критериуми за проценка на H&E хистологија може да се најдат во претходната публикација 3. Разликата на резултатите од хистологијата помеѓу групите анализирани со студентски тестови.

Глувците можат значително да го подобрат или влошат колитисот кај глувци со измамена трансплантација на коскена срцевина (WT WT или KO KO). Ако генот на интерес игра значајна улога во колитис преку клетки добиени од коскена срцевина, глувците со разменета коскена срцевина треба да одговорат значително поинаку од глувците со трансплантирана лажна коскена срцевина.

За моделот DSS колитис, промената на хистологијата може да се оцени со оценување на хистологијата (види Слика 4). Значителна промена во резултатот на хистологија може да укаже на формирање на колитис со посредство на генот од интерес во клетките добиени од коскена срцевина. На пример, кателизидинот е антимикробен и антиинфламаторно пептиден ген (интерес за генот во нашиот случај) 4. Без трансплантација на коскена срцевина, нокаут глувците со кателицидин обично развиваат полош колитис отколку глувци од див тип како одговор на ДСС. Трансфузија на нокаут на кателицидин од коскена срцевина од див тип (WT) доведува до подобрување на колитисот, додека трансфузија на коскена срцевина од глувци со кателицидин (нокаут KO) во глувци од див тип (WT) доведува до влошен колитис кога ДСС (Слика 2) изложени.

За да се потврди изразувањето на интересот на генот, треба да се открие изразување на mRNA-интерес на ген (на пр. Кателизидин) од коскена срцевина од див тип на донор во дебелото црево (или друго) ткиво на глувци примачи на нокаут со недостаток на кателизидин по трансплантација на коскена срцевина. Интересно е да се знае дали изразот на интерес за гени кај глувци приматели од див тип ја намали коскената срцевина по донацијата од нокаут глувци.

Успешната трансплантација на донатор на коскена срцевина е претставена со доминантен однос на изотипот на донаторот ЦД во однос на изотипот на примателот ЦД и во периферните крвни клетки и во коскената срцевина на глувците приматели. Коскената срцевина најдобро го покажува обележувањето на ЦД45.1 и ЦД45.2 во цитометријата на проток, бидејќи крвта има многу не обоени клетки (Слика 2 и 3).

Слика 1. Експерименталниот протокол за трансплантација на коскена срцевина.

Слика 2. Податоци за цитометрија на проток за глувци приматели на коскена срцевина по трансплантација на коскена срцевина. Y-оската го покажува сигналот CD45.1 означен со FITC и X-оската го покажува сигналот CD45.2 означен со PE. Успешното калемење на коските се дефинира со промена на генотипот CD45.1 или CD45.2 и во коскената срцевина и во крвта на глувците приматели. Кликнете овде за да видите поголема слика .

Слика 3. Податоци за цитометрија на проток од глувци приматели на крв по трансплантација на коскена срцевина. Y-оската го покажува сигналот CD45.1 означен со FITC и X-оската го покажува сигналот CD45.2 означен со PE. Успешното калемење на коските се дефинира со промена на генотипот CD45.1 или CD45.2 и во коскената срцевина и во крвта на глувците приматели. Кликнете тука за да видите поголема слика .

Слика 4. Евалуација на колитис кај глувци по трансплантација на коскена срцевина. (А) Примерок H&E слики на дебело црево како резултат на нормална хистологија и ДСС колитис. (Б) Оценки за хистологија. Успешна индукција на DSS колитис може да се потврди со значително зголемување на резултатот на хистологија до 5-ти ден од третманот со DSS. По размената на коскената срцевина во различен генотип, резултатот од хистологијата треба значително да се промени. Ова укажува на изменет тек на колитис предизвикан од изразување на интересот на генот во клетките добиени од коскена срцевина. Податоците се претставени како средна ± стандардна девијација на просекот.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Овој пристап за трансплантација на коскена срцевина е погоден за имунолошки истражувања на колитис, инфекции, рак, дебелина и други болести. Овој експеримент за трансплантација на коскена срцевина е потребен кога генот од интерес е изразен и во клетките на коскената срцевина и во не-коскената срцевина, а за генот од интерес постои сомнение дека посредува во болеста од страна на клетките од двете популации. На пример, прикажано е на антимикробниот пептид кателизидин кој го модулира акутниот колитис. Но, тоа е изразено и во епителните клетки и во имуните клетки (макрофагите). Потоа, имаме коскени графтови да дефинираме која популација на клетки го модулира акутниот колитис кај глувците. Тежината на колитисот беше значително променета по промената на генотипот кателизадин на коскената срцевина со помош на трансплантација на коскена срцевина. Потоа можеме да заклучиме дека кателизидинот изразен во клетките добиени од коскена срцевина игра значајна улога во модулирањето на акутниот колитис како одговор на ДСС.

Од друга страна, постојат многу начини да се следи успехот во трансплантацијата на коскена срцевина. Анализата на проточна цитометрија на генотипите ЦД45.1 и ЦД45.2 може да биде квантитативна метода за одредување на процентот на матични клетки добиени од донатор на коскена срцевина кај глувците приматели. Клетките добиени од коскена срцевина може да се разликуваат во неколку типови на клетки 10. Доколку не е можна анализа на цитометрија на проток, можно е да се користат машки (XY хромозоми) донатори и глувци жени (XX хромозом) приматели. Глувците донатори носат уникатни Y хромозоми во телото на женските глувци кои примаат само XX. Y хромозомот може да се идентификува со флуоресценција in situ хибридизација 11. Дополнително, може да биде потребна имунохистохемија на CD45.1, CD45.2 и/или ген од интерес во ткивата за да се визуелизираат клетките добиени од донатор на коскена срцевина.

Но, Цитометриската анализа на проток на ЦД45 и процедурите за хибридизација на инфицираниот хромозом Y обично се изведуваат по убиството на глувците. Со цел да се следи положбата на донаторските клетки кај глувците приматели кои се користат за следење на хронични заболувања како што е ракот без да се испитаат глувците, можно е да се користат трансгени глувци со зелен флуоресцентен протеин како глувци донатори 12. Затоа, клетките добиени од донаторската коска клетка можат да се следат во телото на глувците приматели со употреба на неинвазивна оптичка слика со висока резолуција под минлива анестезија и тоа може да се направи постојано.

Не сите глувци имаат успешна трансплантација на коскена срцевина 13. Наб observedудувавме,

10-20% од глувците умираат од анемија или инфекција во првите 2 недели по зрачењето. Затоа, на почетокот на експериментот треба да се направат повеќе глувци отколку што е потребно. На пример, треба да подготвите 10 глувци по група на почетокот на експериментот, ако очекувате 8 глувци по група до крајот на експериментот со колитис. Значи, проверете дали ги отстраните мртвите глувци што е можно поскоро. Стапката на имунолошка реконституција е во корелација со бројот на хематопоетски матични клетки во коскената срцевина инфузирана во глувци приматели 14. Затоа, од клучно значење е да имате доволен број на живи клетки на коскена срцевина (1 x 10 7 клетки на глушец) внесени во глувци приматели за успешна трансплантација на коскена срцевина.

Глувците приматели по зрачењето биле нарушени со имунитет. Постапките за дисекција на глувци донатори и подготовка на коскена срцевина треба да се изведуваат во ист стандард како и експериментите со клеточна култура. Користејќи стерилни инструменти и контејнери, треба да се применат асептички услови. Во сите експерименти, PBS содржи 1% пеницилин-стрептомицин и 10 U/ml хепарин треба да се користат при ракување со коски од градинарска тиква. Сите реагенси се за клеточна култура. Понатамошна техничка дискусија може да се најде во упатството 13.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Откривање

Не е прогласен конфликт на интереси.

Признанија

Оваа работа беше финансирана од пилот грант за студија за изводливост од Центарот UCLA-CURE, Награда за развој на кариера на Фондацијата Кронова болест и колитис (број 2691) и финансирање на Националниот институт за здравство NIDDK K01 (DK084256) за Хон Ваи Кун.

Операцијата за зрачење на коскената срцевина беше поддржана од Бернард Левин и Скот Кичен од Центарот за истражувања на СИДА во глувчето UCLA/Основно јадро за химера. Операцијата на цитометрија на проток беше поддржана од објектот Вектор-јадро на UCLA.