Регулирање на цитичниот скелет на актин во клетките на пацинксот ацин од тирозин киназа Да - PDF

Универзитет Улм, Одделение за внатрешна медицина, раководител на проф. Г. Адлер Регулирање на актинскиот цитоскелет во клетките на пацинксот ацин со тирозин киназа Да Дисертација за добивање на докторски степен по биологија на човекот (д-р Биол. Хум.)

цитичниот

Вршител на должноста декан: проф. Клотц 1. Известувач: ПД Др. Луц 2-ри известувач: Др. Ден на докторат: 20 декември 2002 година

Посветеност на моите родители кои секогаш ги поддржуваа моите соништа

Содржина 1 СОДРИНА СОДРИНА СОДРИНА. 1 КРАТКИ 3 1. ВОВЕД. 5 2. ЦЕЛ. 19 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ. 20 3.1. Материјал и животни. 20 3.1.1. АНТИБОДИЈА. 20 3.1.2. ХЕМИКАЛИ 21 3.1.3. ANИВОТНИ ИВОТНИ. 21 3.2. Методи. 22 3.2.1. ИЗОЛАЦИЈА НА АЗИНИ ОД Панкреасите на стаорци. 22 3.2.2. СТУДИИ ЗА СМЕТКА ЗА АМИЛАЗА ВО СВЕО ИЗОЛИРАН АЗИНИ РАТ. 23 3.2.3. ИМУНЕЛЕН ФЛУЕРЕСЕН ЛЕК. 23 3.2.4. ПРОИЗВОДСТВО НА ПРОТЕИНСКИ ИЗВОЗИ. 24 3.2.5. ОДРЕДУВАЕ НА ПРОТЕИНСКАТА КОНЦЕНТРАЦИЈА. 25 3.2.6. НАДВОЛЕДНА ФРАКЦИЈА. 26 3.2.7. ИМУНПЕЦИПИТАЦИЈА. 27 3.2.7. ГЕЛСКА ЕЛЕКТРОФОРЕТСКА АНАЛИЗА НА ПРОТЕИНИ ОД СДС-СТРАНИЦА. 28 3.2.8. БЕЛТИНГ НА ЗАПАД. 29 3.2.9. Откривање на протеини со антитела. 29 3.2.10. ИНДИГА ИНКАСИРАЕ. 30 3.2.11. КИНАСА АКТИВНОСТ НА ДА. 31 3.2.12. ДЕНЗИТОМЕТРИСКО ОЦЕНУВАЕ НА ИМУНОБЛОТИ. 32 3.2.13. ИЗОЛАЦИЈА НА РНК ОД АЗИНИ. 32 3.2.14. Проверка на чистотата и квалитетот на РНК. 32 3.2.15. ХИБРИДИЗАЦИЈА НА RЕНИЧКИТЕ ЛИСТИ. 34 4. РЕЗУЛТАТИ. 37

Содржина 2 4.1. Регулација на ниво на протеини. 37 4.1.1. Протеинско изразување на киназите на СРЦ. 37 4.1.2. ФИОСФОРИЛАЦИЈА НА ТИРОЗИНА ОД ДА СТИМУЛАЦИЈА НА ЦКК. 38 4.1.3. КИНСКА ДЕЈНОСТ НА ДА. 41 4.1.4. ЛОКАЛИЗАЦИЈА И РЕДИСТРИБУЦИЈА НА ДА. 44 4.1.5. КОРЕЛАЦИЈА МЕWУ РАЗБИРАЕ НА АКТИН И ДА АКТИВНОСТ. 46 4.1.6. ТАЈНА ОД ИЗОЛИРАНА АЗИНИ. 49 4.1.7. ПРОТЕИНИ Здружени со ДА. 51 4.2. Изразување на гените. 53 4.2.1. ИСПИТУВАЕ НА КОНЦЕНТРАЦИИТЕ ЗА ИЗОЛАЦИЈА НА РНК. 54 4.2.2. ИЗРАЗУВАЕ НА ENЕНИ ПО СТИМУЛИРАЕ СО CCK. 55 5. ДИСКУСИЈА. 60 5.1. Регулирање на протеини. 60 5.2. Диференцијално изразување на гени. 66 6. РЕЗИМЕ. 69 7. СПИСОК НА ЛИТЕРАТУРА. 71 ПРИЛОГ. 83

Кратенки 3 КРАТКИ Слика Слика вода Двојно дестилирана вода BSA Bov Bovine Serum Albumin CCK холецистокинин CCK-R CCK рецептор ECM екстрацелуларен матрикс и други и други експерименти Експеримент FAK фокусна адхезија киназа грамови IB имуноблот IF имунофлуоресценција IgG имуноглобилин хип имуноблобилин G IP + + Лесни (двата лада на IgG) HRP рен пероксидаза (рен пероксидаза) kda килоодалтон кг килограм M моларна минута mk моноклонална ml милилитар μg микрограм N нормален nm нанометар nm наномоларен PBS фосфат-пуфер солен раствор PMSF фенилметилен сулфонил флуорид флуорид

Кратенки во 16 часот пикомоларна PVDF поливинилиден дифлуорид Pyk2 богата со пролин тирозин киназа 2 RT собна температура SDS натриум Додецил сулфат СЕМ стандардна грешка SH Src хомологија ТБС Трис-пуфер солен раствор Тир тирозин пр. на пример

1. Вовед 12 Ахеренсов спој (Охкубо и сор. 1999). p120ctn не е директно вклучен во интеракцијата на протеини-протеини со системот на актински филаменти, бидејќи не може да се поврзе со α-катенин. Еден можен механизам за регулација на протеините на зонулата е адхерентен тирозин, бидејќи β- и γ-катенин, како и p120ctn може да се фосфорилираат тирозин со стимулација со фактори на раст (Hazan et al. 1998; Rosato et al. 1998). P120ctn ја стабилизира адхезијата на клетките на клетките со врзување со Е-кадерин (Yap et al. 1998); ова е инхибирано од хиперфосфорилацијата на p120ctn за време на митозата (Хазан и сор. 1998). Тирозин-фосфорилацијата на катенините може да игра клучна улога во стабилноста или нестабилноста на зонуларните приврзаници, а со тоа и закотвување на системот на актин-филамент со плазматската мембрана (Behrens et al. 1993). Во студиите на изолирани ацини, исто така, беше забележана промена во степенот на фосфорилација на p120ctn по стимулација со супрамаксимална секреторна концентрација на CCK (Лесер и сор. 2000).

1. Вовед 14 ФАК и паксилин во прашање. Сите 3 протеини се опишани како супстрати на кирза Src во други клеточни системи (Калаути и сор. 1998); (Шлајфер и сор. 1999; Шен и сор. 2001). Семејството на Src кинази вклучува 9 протеини со изразена структурна хомологија. Повеќето кинази од семејството Срц се изразени само во хематопоетски клетки, каде што тие често се излишни, како што беше прикажано во нокаут-моделите (Смит и сор. 2001). Од друга страна, киназите на Срц Да, Лин, Фан и Срц се секаде изразени и се чини дека имаат различни улоги (Томас и сор. 1995). Src киназите првично се локализирани во цитоплазмата и, како активни ензими, се врзуваат скоро исклучиво на клеточните мембрани. Врз основа на хомологии на секвенци, можат да се диференцираат вкупно шест функционално релевантни домени со различни задачи (Слика 3). (Браун и сор. 1996)

1. Вовед 17 на преклопениот протеин и не може да се фосфорилира (Гонфлони и сор. 2000). Врзувањето на подлоги со доменот SH2 е исто така тешко. Постојат неколку опции за активирање на кирназите на Src: Дефосфорилација на Tyr 527 со конкурентно врзување на фосфатаза на супстрат со висок афинитет до доменот SH2 или SH3, при што фосфорилираниот Tyr 527 е раселен алостеричен активатор или модификација на протеинот (на пр. Серин/треонин фосфорилација) што е затворено Дестабилизирана конформацијата. Во сите случаи, протеинот се расплетува и е можна автофосфорилација на доменот на киназата (слика 4). Ова ја активира киназата. Csk е опишан како негативен регулаторен протеин, кој е одговорен за фосфорилацијата на Tyr 527 (Браун и сор. 1996).

1. Вовед 18 PTyr 527 Tyr 527 неактивни активни Сл. 4: Регулирање на активноста на Src киназите. Во неактивна форма (лево) протеинот е во многу преклопена состојба. Во активна форма, доменот SH3 се одвојува од спиналот богат со пролин, а доменот SH2 повеќе не се врзува за регионот на опашката (сега со остаток на нефосфорилиран тирозин). Активната страна го врзува АТП (црвено), што ја држи фосфатната група подготвена за активирање. Првата реакција е фосфорилација на остатокот од тирозин веднаш до местото на врзување на АТП (автофосфорилација). Кога овој тирозин се фосфорилира, ензимот е максимално активиран. (по Годсел 2001)

3. Материјал и методи 20 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ 3.1. Материјал и животни 3.1.1. Антитела Следната табела (Табела 2) ги прикажува сите примарни антитела/антисери кои се користат и нивните извори. Производител на назнака Производител IB IP IF Да Глушец, мк Трандукција 1: 5000 Pyk2 глушец, мк Трансдукција 1: 1000 Pyk2 зајак, Biomol, pk Хамбург Фоспотирозин (PY20) глушец, мк Трансдукција 1: 2500 Срц глушец, мк UBI 1: 200 зајак Fyn, pk UBI 1: 500 Lyn Hase, pk Santa Cruz 1: 500 FAK глувче, mk Трансдукција 1: 1000 P120ctn глушец, mk Трансдукција 1: 1000 3 5 μg, за 350 750 μg протеин 5 μg за 750 μg протеин 5 μg за 650 μg Протеин 1: 1000 1: 200 Табела 2: Примарни антитела Сите секундарни антитела заедно со пероксидаза се добиени од Пирс. За боење на имунофлуоресценција, беа добиени Алекса 488 споени секундарни антитела од Молекуларни сонди (Јуџин, САД) и Cy3 споени секундарни антитела од Дианова (Хамбург).

3. Материјал и методи 21 3.1.2. Хемикалии Име на аминокиселини (не е од суштинско значење, MEM 100x) CCK-8, сулфатиран (CCK 25-32) колагеназа, (CLSPA) Л-глутамин Орегон Зелен-фалоидин говедски серумски албумин (BSA) Соја Трипсин Инхибитор Производител на Life Technologies, Карлсруе Бахем, Бубендонф, Швајцарија, Cell Systems, Hamburg Life Technologies, Karlsruhe Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Fluka, Buchs Boehringer, Mannheim Табела 3: Супстанции Сите други хемикалии биле, освен ако не е поинаку наведено во текстот, на стр. A. или ултра чист квалитет од производителите Флука (Бухс), Мерк (Франкфурт), Рот (Карлсруе) и Сигма (Дејзенхофен). 3.1.3. Animивотни Тестните животни беа машки стаорци Вистар од родот WAG/RijCrl (река Чарлс, Сулцфелд). Theивотните се чуваа во групи со максимум 3 стаорци на кафез под контролирани светло-темни услови, со 12-часовна темна фаза помеѓу 19 и 7 часот наутро. Собите беа климатизирани (21 С собна температура, 55% влажност). Theивотните се хранат со диета за размножување и сточарство Алтромин ad libitum. Во експериментите користевме стаорци со тежина од 100-200 g, кои постеа преку ноќ.

3. Материјал и методи 24 блокирани во PBS. Примарните антитела (во PBS) се инкубираат или 1 час на собна температура или преку ноќ на 4 C. Слајдовите потоа се мијат три пати со PBS. Инкубацијата со секундарно споено антитело со флуорохром или со 0,2 µm конјугиран фалоидин од Орегон Грин се одвиваше два часа во темница на собна температура. Слајдовите потоа беа измиени три пати пред да се вградат ацините во Мовиол (Калбиохем, Бад Соден) и да се нанесат на слајдовите. Анализата на дамките од имунофлуоресценција е извршена со конфокален микроскоп за ласерско скенирање (TCS 4D, Leica, Хајделберг). 3.2.4. Производство на протеински екстракти Во зависност од проблемот, се користеа следните пуфери за лиза. Деоксихолат/Тритон лифер пуфер: Tris/HCl, pH 7,5 50 mm NaCl 150 mm EGTA 1 mm EDTA 0,4 mm Triton X-100 1% деоксихолат 1% (wt/вол) Na ортованадат 0,5 mm Na- Флуорид инхибитор на трипсин соја од 5 мм 1 мг/мл ПМСФ 1 мм апротин 1,4 μг/мл леупептин 10 μг/мл Овој пуфер се користеше за анализа на тирозин-фосфорилирани протеини и за утврдување на активноста на киназата.

3. Материјал и методи 25 DTT/Triton X-100 лиферски пуфер (според Антитела Array, Biocat, Хајделберг): Tris/HCl, pH 7,5 15 mm NaCl 120 mm KCl 25 mm EGTA 2 mm EDTA 2 mm DTT 0,1 mm Triton X-100 0,5% Na ортованадат 0,5 mm Na флуор 5 mm соја инхибитор на трипсин 1 mg/ml PMSF 1 mm апротин 1,4 μg/ml леупептин 10 μg/ml Овој пуфер се користеше за ко-имунопреципитација користените протеински комплекси Yes-Pyk2. Соодветните стимулации беа запрени со додавање на ладен пуфер KRH и потоа клетките се пелетираа на 500 × g. Супернатантот потоа беше вшмукан и ацините беа повторно суспендирани во 200 400 μl пуфер за лиза и хомогенизирани со ултразвук 5 секунди. Последователната инкубација на мраз траеше 30 минути за изолација на протеински протеински комплекси и 10 минути за сите други изолации. Нерастворливите се пелетираа со центрифугирање најмалку 20 минути на 10 000xg на 4 ° C. 3.2.5. Определување на концентрација на протеини Содржината на протеини во екстрактите е утврдена со употреба на модифициран метод Брадфорд со употреба на BioRad Protein Assay (BioRad, Минхен) и линија за калибрација на BSA (0,7 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0, 1mg/ml).

3. Материјал и методи 28 3.2.7. Гел електрофоретичка анализа на протеините со употреба на SDS-PAGE пуфери (според Lämmli 1970): 10 × SDS пуфер за трчање Tris 25 mm глицин 191 mm SDS 10% (без напон) раздвојувачки гел пуфер Tris, pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % Тампон за гел за редење Tris, ph 6,8 0,5 M SDS 0,4% 4 x СДС пуфер за примерок Tris, ph 6,8 250 mm глицерол 40% SDS 10% 2-меркаптоетанол 20% бромофенол сино 1 mg Систем на дисконтинуиран Електрофореза на гел-полиакриламид во модифицирана форма според употребениот Lämmli 1970 година. Mini-Protean II (BioRad, Минхен) служеше како апарат за електрофореза. Беа применети 20 μg од вкупниот протеин на лизатите или супернатантот на имуноципитатите, кои претходно беа измешани со 4x SDS-тампон примерок и топлински денатуриран (5 мин, 95 ° C). Електрофорезата се одвиваше со постојана јачина на струја од 20 ma во гелот за собирање и 35 ma во гелот за одвојување.

3. Материјали и методи 32 и реакцијата на киназа беше спроведена со ATP концентрација од 10 mm на 37 ° C за еден час. Сите понатамошни чекори беа обработени во согласност со упатствата. Апсорпцијата е измерена на 405 nm (референтна бранова должина 620 nm). 3.2.12. Дензитометриска проценка на имуноблоти За густинометриска споредба на јачините на опсегот, изложените рендгенски филмови беа скенирани со помош на пренесен скенер за светло (Sharp JX-330) и анализирани со 1D софтвер од Phoretix (New Castle upon Thyne, Велика Британија). 3.2.13. Изолација на РНК од ацини Стимулацијата на изолирани ацини беше запрена со ладен РБС-ладен РБС, центрифугиран на 1000 вртежи во минута за 5 минути и супернантот се исфрли. РНК беше изолирана според протогалот на Прмега (SV Total RNA Isolation System, Promega, Mannheim). 3.2.14. Проверка на чистотата и квалитетот на определувањето на концентрацијата на РНК Изолираната РНК е разредена 1: 100 со вода и апсорпцијата се мери на две различни бранови должини. Концентрацијата на РНК е пресметана од апсорпцијата на 260 nm и чистотата на изолираната RNA е добиена од односот 260/280 nm. Пресметка на концентрација: апсорпција од 1 = 40 µg/ml

3. Материјал и методи 34 малку измешани. Примероците беа натоварени во гелот и одделени на 50 V околу 1-2 часа. 3.2.15. Хибридизација на генските низи Прехибридизација на филтрите 0,5% SDS се вари и мембраните (GF300 - GeneFilters Rat Microarrays Release 1, Res Gen, Invitrogen) се инкубираат со овој раствор 10 минути на собна температура пред секоја предихибридизација. 90 μl ДНК на спермата од лосос (ssdna) се вареше 5 минути на 95 ° C и кратко се ладеше на мраз. Ssdna и 120 μl trna потоа беа додадени на 12 ml пуфер хибридизација. Предхибридизацијата се спроведуваше неколку часа на 42 ° C во рерната за хибридизација. Префибридирачки пуфер: формамид 50% SSC 6x Denhardt s 5x NaPO 4 50 mm SDS 0,5% реакција на обратна транскриптаза (РТ) 25 μg РНК испарија во секој случај на 11 μl течност во Speed ​​Vac. Комплетот Ambion Strip-EZTM RT (Ambion, Остин, TX) беше користен за RT. 25 µg РНК/11 µl 2 ml Олиго (dt) од Амбион.Оваа смеса се вареше на 65 ° C 5 минути и потоа се ладеше на 42 ° C. Потоа беше додадено следново:

3. Материјал и методи 35 2 μl 10x RT тампон 2 μl 10x dntp 1 μl MMLV RT (обратна транскриптаза) 2 μl (= 20 μci) P 33 -α datp (Amersham) RT се изведуваше на 37 ° C за 1 2 часа . Прочистување на cdna Најпрво беше спроведено варење на RNAse H за да се отстрани RNA. За ова, 1 примерок од RNAse H беше додаден во примерокот и се инкубираше на 37 ° C. 30 минути. ЦДНА беше прочистена со употреба на комплет за отстранување на нуклеотиди (Qiagen, Hilden). По прочистувањето, примерокот се елуира од колоните со 50 μl EDTA (50 mm). Конкуренција на повторуваните cdna секвенци Мешавина на конкуренција: 50 μl 20x SSC 70 μl 10 mm Tris ph 8,0 45 μl Хиблок стаорец (1 мг/мл) (применети лаборатории за генетика, Мелбурн, Австралија) 20 μл 1% СДС Мешавина на конкуренција и прочистената ЦДНА беа денатурирани одделно 5 минути на 95 C и веднаш се ладеа на мраз. Потоа, двете серии беа комбинирани и инкубирани на 56 ° C. 40 минути. Конкурентското ЦДНА беше пипетирано во свеж раствор за претхибридизација и се додава во генетските филтри. Хибридизацијата се спроведуваше најмалку 18 часа на 42 C во рерната за хибридизација.

3. Материјали и методи 36 Перење на филтрите Примерокот беше отфрлен и филтрите се миеја двапати 5 минути со 2x SSC; 0,1% СДС се мие на РТ. Ова беше проследено со уште две строги чекори за перење на 68 ° C со 0,2 SC SSC; 0,1% SDS за 15 мин секој пат Генските низи беа ставени помеѓу 2 слоја филтер-хартија за да се отстрани преостанатата течност и се завиткаа во фолија. Екран со фосфор (Кодак, Штутгарт) се применуваше околу 5 дена. Сигналот беше скениран со употреба на скенер за фосфор (Молекуларна динамика, Amersham Biosciences, Санивил, Калифорнија) и евалуиран со користење на софтверот Array Vision 6.0 (Истражување на слики).

4. Резултати 37 4. РЕЗУЛТАТИ 4.1. РЕГУЛАЦИЈА НА ПРОТЕИНСКОТО НИВО 4.1.1. Изразување на протеини на кирназите на Src За да се испита шемата на изразување на протеините на кирза Src во ацинарни клетки на панкреасот на стаорец, 20 μg вкупни протеини беа извлечени од изолирани ацини на панкреасот на стаорци и одделени со електрофореза. Протеинот беше пренесен во PVDF мембраната во размачкан вестер и се испитува за изразување на секаде изразените кинази од семејството Src. Антитела против киназите Да, се користеа Src, Lyn и Fyn. Да и Лин се изразени во ацинарните панкреасни клетки на стаорецот WAG, додека Src и Fyn не можат да се детектираат (Слика 5). За киназата Src користиме контрол (клеточен лисат од клеточна линија A431) бидејќи Src е опишан во ацинарните клетки во литературата (Nozu et al. 1999). Сепак, кирза Src не може да се открие кај нашите стаорци. IB: Да Lyn Fyn Src 1 2 3 4 5 Сл. 5: Изразување на кинази од семејството Src во ацинарните клетки на стаорецот WAG. Патеки од 1 до 4: вкупен протеин; Лента 5: позитивна контрола за Src (клеточен лизат од А431).