Смак миметиците предизвикуваат некротично воспаление и смрт на туморските клетки со модулирање на
предмети
апстрактен
Макрофагите се пластични клетки кои се карактеризираат со различни состојби на активирање. 23 Класично активираните макрофаги (М1) и алтернативно активираните макрофаги (М2) ги претставуваат двете крајности во спектарот на фенотипот на макрофагите.Макрофагите поврзани со туморот се класифицирани како макрофаги М2 врз основа на нивниот профил на изразување на цитокин; 24 Тие произведуваат високо ниво на имуносупресивни цитокини како што е интерлеукин-10 (IL-10) и, претежно во цврсти тумори, делат некои функции за обновување на ткивата со фибробластите. Спротивно на тоа, макрофагите М1 произведуваат големи количини на про-воспалителни цитокини, вклучително и интерферон-γ. (IFN γ) и IL-12, и може да бидат вклучени во активирање на ефективен имунолошки одговор против тумори. Пластичноста на макрофагите сугерираше нови терапевтски пристапи насочени кон пресврт на фенотипот М2 26, особено кај тумори во кои инфилтрацијата на макрофагите, како што е карциномот на јајници, игра суштинска улога. Соодветно на тоа, макрофагите во моделот на асцити на јајниците на глувчето беа генерирани со модулирање на NF-? Препрограмирана сигнализација Б. 27
Неодамна ја опишавме синтезата на нови димерни молекули насочени кон XIAP, cIAP1 и cIAP2. 28, 29 Една од овие молекули, СМ83, го инхибира растот на чувствителниот СМ аденокарцином на дојка кај луѓето МДА-МБ231 и рабдомиосаркомот Ким-1, но не и на другите клеточни линии. Овде користиме два глувци ксенографт модели на асцит на рак за да покажеме дека SM83, кога се администрира во монотерапија, го зголемува преживувањето на овие глувци насочувајќи се кон макрофагите поврзани со туморот. Со помош на TNF, SM83 брзо предизвикува некроза на интраперитонеално (ip) инјектирани клетки на рак кои инаку се целосно отпорни ин витро на антитуморни ефекти на SM83. Нашата работа покажува дека SM83 има различни механизми на дејство in vitro и in vivo и дека ја извршува својата антитуморна активност in vivo преку стимулирање на имунолошкиот систем.
Резултати
SM83 ја сензибилизира клеточната линија IGROV-1 на карцином на јајници на апоптотичните ефекти на TRAIL
SM83 предизвикува апоптоза ин витро кога се комбинира со TRAIL. ( а ) Хемиска структура на димеричниот SM SM83. ( б ) На IGROV-1 клетките им беа дадени 0, 1 или 1, 0 μ M SM83 третиран сам или во комбинација со 2 или 10 ng/ml ТРАИЛ. Растот на клетките се изразува како процент во однос на клетките третирани со возила. Вредностите се просечна и SD од експеримент кој е репрезентативен експеримент на три извршени експерименти. ( в и г. ) Western blot анализа на XIAP, cIAP1, cIAP2 и расцепкан PARP (Cl PARP) во клетките IGROV-1 кои биле третирани со SM83 ( в ) или SM59 (SM-164) ( г. ) Третиран во отсуство на или присуство на 10 ng/ml ПАТ. Актинот е прикажан како контрола на полнежот. Стрелка, специфична лента XIAP
Монотерапија СМС го зголемуваат преживувањето на глувците со асцит на рак
СМ83 и СМ59 потоа биле тестирани ин виво со употреба на модел на ксенографт кај глувци во кој клетките на ИГРОВ-1 биле инјектирани ip во атимски голи глувци, што резултирало со асцит и смрт. Третманот и со SM83 (2a) и со SM59 (2b) го зголеми преживувањето на глувчето (П.
Третманот со СМ83 при монотерапија го зголемува преживувањето на глувците со рак на асцит. ( а ) На голи глувци им се инјектира IP со клетки IGROV-1 и се оставаат нетретирани (О) или третирани 5 пати неделно 2 последователни недели од денот по инјектирањето со 5 mg/kg SM83 (l), 2,5 mg/kg ПОДОЧНИК ( ∇) или со иста доза на SM83 и TRAIL заедно (▪). Прикажан е експеримент што претставува два извршени. Секоја група за третман содржи седум глувци. Крива на преживување за глувци третирани со SM83 и контроли. ( б ) Крива на преживување за глувци третирани и контролирани со СМ59. Нетретиран (○) или третиран со SM SM59 (). ( в Формирањето на асцит е проверено со следење на телесната тежина на 17-тиот ден. ( г. и д ) Клетките на Мет А биле инјектирани во глувци BALB/c и биле третирани со 5 mg/kg SM83 дневно од 7-ми ден. ( г. Формирањето на асцит е проверено со следење на телесната тежина на ден 13. Хоризонталната линија ја претставува средната вредност. ( д ) Крива на преживување за нетретирани () или SM83 третирани глувци () од 7-ми ден
За да тестираме дали in vivo активноста на СМ83 е специфична за клеточната линија или е ограничена на глувци со имунодефициенција, користевме друг модел на асцит во кој клетките на сарком Мет А беа инјектирани ip во имунокомпетентни синхеински глувци БАЛБ/ц. Слично на клетките на IGROV-1, клетките на Мет А не биле инхибирани од растот на SM83 ин витро (податоците не се прикажани). Кај глувците, SM83 ја намали прогресијата на асцитот, што се сметаше за помало зголемување на телесната тежина (2д) и го зголеми просечното време на преживување од 15 дена за нетретирани животни на 26 дена (P = 0,0721; 2e). И во овој модел комбинацијата со TRAIL не беше поволна (податоците не се прикажани). Кога глувците излекувани со СМ83 (4 од 14 тестирани глувци) добија нова инјекција од 4 × 10 5 Мети А клетки (двојно повеќе од првата администрација), нема нови асцити (податоците не се прикажано). Овие резултати сугерираат дека овие животни развиле адаптивен имунитет.
SM83 брзо ги убива клетките на ракот кои лебдат во асцит преку не-апоптотски механизам
За да се проучи механизмот на SM83 активност in vivo, течноста за асцит беше собрана од глувци инјектирани со клетки IGROV-1 и третирани со SM83 3, 6 или 24 часа и беа изброени туморските клетки. Резултатите покажаа забележително намалување (П.
За да го разбереме механизмот на клеточна смрт, одговорен за намалувањето на бројот на лебдечки туморски клетки во асцитите, го испитавме изразот на медијатори на апоптоза во овие клетки во различни временски точки. По 24 часа, третманот со СМ83 резултираше со само мало зголемување на расцепениот ПАРП, нема докази за расцепена, активна каспаза-8 (што се очекуваше затоа што овие клетки се убиени со СМ монотерапија in vivo) и само мал ефект на деколтето на каспаза -3 (Слика 3д). Спротивно на тоа, клетките третирани со TRAIL покажаа поголемо активирање на овие апоптотични маркери, иако TRAIL беше неефикасен во намалувањето на бројот на клетки на асцитите (Дополнителна слика S1). Во обид да се откријат апоптотичните настани, беше извршено размачкување на Вестерн врз клетките собрани по 3 и 6 часа третман (3е). И во овој случај, SM83 предизвика целосна деградација на cIAP1 и cIAP2, но имаше само слаба акумулација на расцепените форми на PARP, каспаза-8 и каспаза-3. Ова мало активирање на апоптотската каскада посочи дека причината за смртта на клетките на туморот на асцитите не е примарно апоптотична.
За да се процени можноста дека автофагијата - друг механизам што може да доведе до смрт на клетките кога е ненормално и континуирано активиран - е одговорен за губење на клетките на туморот во асцит, ги измеривме нивоата на Беклин-1 и расцепкан LC3B. Третманот со СМ83 не ги зголеми нивоата на овие протеини (Дополнителна слика С2), што сугерира дека автофагијата не е вклучена во смртта на туморските клетки предизвикани од СМ83.
SM83 предизвикува воспалителен настан in vivo
Третманот СМ83 предизвикува експресија на воспалителни цитокини in vivo. На голи глувци им биле инјектирани IP клетки IGROV-1 и биле третирани со единечна доза од 5 mg/kg SM83 или не; Асцитите беа собрани 3, 6 и 24 часа по администрацијата на СМ83. ( а ) SM83 привремено го зголеми нивото на TNF на глувчето измерено со ELISA. ( б ) Третманот со СМ83 го намали бројот на клетки на асцит, но овој ефект беше блокиран кога ТНФ беше сексортиран со поголема доза на етанерцепт (П = 0,0118 во споредба со третманот само со СМ83). ( в ) Западни флеки на протеини на туморски клетки од асцит од нетретирани глувци и глувци третирани само со СМ83 или во комбинација со 150 мг/кг етанерцепт. Стрелка, специфична лента за XIAP. ( г. - Х. ) Резултати од ELISA за IL-1? ( г. ), IFN-? ( д ), IL-10 ( ѓ ), трансформирајќи го факторот за раст & бгр; (TGF-?) ( Г. ) и IL-4 ( Х. ) во асцитната течност од глувци третирани како погоре. Резултатите за IL-10 се прикажани како индукција на пати, како резултат на недостаток на стандард на рекомбинантен протеин
SM83 промовира активирање на макрофагите кон фенотип сличен на М1
Третманот СМ ги активира макрофагите и ги сензибилизира до некротична смрт. ( а и б ) BALB/c BMDM (5 × 10 5) беа засадени во плочи со 96 бунари, оставено да се лепи 16 часа и им беше инјектирано 1 μl до 24 часа. Со М SM83 постапува или не. Третманот СМ83 промовираше лачење на проинфламаторни цитокини TNF ( а ) и IL-1β ( б ) ( в ) НФ-? Активирање на Б од SM83 проценето во макрофагената клеточна линија RAW стабилно трансфектирано со NF-? Носител на генот на Б-луцифераза. Прикажан е репрезентативен експеримент на два извршени. Вредностите се средни и SD; n = 3. ( г. и д ) BALB/c BMDM беа засадени во шест бунари, оставено да се лепи 16 часа и се третира со сериски разредувања на SM83 во отсуство или присуство на некростатин-1 или z-vad-fmk за да се инхибира некроптозата или апоптозата, соодветно. ( г) Претставнички слики кои ја прикажуваат морфологијата на клетките по 24 часа лекување. ( д ) Одржливост на клетките по проценети третмани со помош на анализата CellTiter-Glo
Да се исклучи можноста дека IL-1-индуциран од SM83? Секрецијата се должи на контаминација со липополисахариди (LPS), подготвивме BMDM од глувци со нокаут TLR4 (KO) и откривме дека IL-1? се лачеше во слична мера како што се лачеше од клетките BALB/c (Дополнителна слика S4). Покрај тоа, беше откриено дека препаратите за инјектирање SM83 не содржат забележливи количини на LPS во тестот Ендосафе ПТС (лаборатории на реката Чарлс, Калко, Италија) (податоците не се прикажани). Овие резултати покажуваат дека IL-1-индуциран од SM83? -Производството не се должеше на контаминација со ЛПС.
Бајдандер акумулација на неутрофили во асцити
Неутрофилите потоа беа изолирани од слезината на глувците со BALB/c (див тип) и недостаток на рецептор 1 на TNF (TNF-R1) со цел да се испита улогата на неутрофилите во антитуморна активност на SM83 in vitro. Во Трансвел анализите, миграцијата на неутрофили од див тип кон асцити од глувци третирани со СМ83 беше поголема од онаа кај нетретирани глувци (6д). Инхибиторот на HMGB-1 делумно ја намали миграцијата, додека неутрофилите од глувци со недостаток на TNF-R1 не мигрираа како одговор на асцити од глувци третирани со СМ83. Асцити од глувци третирани со SM83-активирани неутрофили од див тип за да произведат супероксид дури и во присуство на блокаторот на ЕНТ етанерцепт, додека глициризинот целосно ја блокираше оваа активност (6е). Овие резултати сугерираат дека миграцијата на неутрофилите во присуство на асцит од глувци третирани со СМ83 е стимулирана од TNF, додека активирањето се должи на HMGB-1. Важноста на TNF за миграција на неутрофили, исто така, беше демонстрирана in vivo, каде што предтретманот со етанерцеп го блокира регрутирањето на овие клетки во асцитите (Дополнителна слика S5).
Сумирајќи, нашата работа покажува дека SM83 дејствува ин виво во асцит на карцином со враќање на макрофагите од фенотип сличен на М2, кој го поддржува туморот, во фенотип сличен на М1, кој е обдарен со антитуморна активност. М1 макрофагите лачат цитокини како што се TNF, IL-1? и IFN? предизвикување брза некротична смрт зависна од TNF на клетки на рак на асцит (7); Клетките што умираат потоа ослободуваат HMGB-1, кој заедно со TNF стимулира масивна инфилтрација на неутрофили.
Предлог механизам на дејство на SM83 кај асцит на рак. SM83 го стимулира пресвртот на макрофагите од фенотипот М2 во М1. TNF излачуван од M1 макрофагите предизвикува некротична смрт на клетките на ракот во течноста асцит; Клетките што умираат ослободуваат HMGB-1, кој заедно со TNF регрутира неутрофили
дискусија
Во оваа студија ја опишуваме ин виво активноста на ново синтетизираниот SM SM83 во два модели на ксенографт за асцит на рак кај глувци. Покажуваме дека SM83 е ефикасен како монотерапија in vivo врз клетки на рак на човечки и глувци кои се отпорни на СМ ин витро, и покажуваме дека овие клетки умираат со не-апоптотичен, зависен од TNF механизам. Ние исто така обезбедуваме докази дека SM83 ја работи својата работа со активирање на воспаление и активирање на имуните клетки, што резултира во имуногена смрт на клетките на ракот. Покрај тоа, нашата студија покажува дека активноста на SM83 (а можеби и на други SM) во комплексот in vivo средина се разликува од онаа веќе забележана in vitro.
Во микросредина на тумор, вклучувајќи рак на јајници, макрофагите се здобиваат со фенотип сличен на М2. 38, 39 Сепак, некои автори предложија различни стратегии 23, 24 кои можат да го разменат статусот на макрофагите во насока на ефективна реакција против туморот. Во овој контекст, исто така беше прикажана можноста за зголемување на ефикасноста на стандардните терапии што ги нарушуваат М2 макрофагите, 40 особено кај тумори чија прогресија се потпира строго на нивната поддршка, како што е карциномот на јајници. Овие тумори создаваат комплексна врска со поврзаните имунолошки клетки во асцитите, 41 и развиваат имуносупресивна микросредина произведена од макрофаги. Затоа, кај рак на јајници, реполаризирање на макрофагите или инхибиција на нивното регрутирање може да биде нова ефективна терапевтска стратегија.
Нашите резултати сугерираат дека СМС го регулираат имунолошкиот одговор на асцит на рак со поларизирање на макрофагите и на тој начин имаат терапевтски потенцијал. Всушност, Smac/DIABLO 42 и мимитичкиот SM83 прикажан овде предизвикува некротична или некротична клеточна смрт. Некротичните клетки, освен апоптотичните, ослободуваат неоксидирана, имуногена форма на алармин HMGB-1 43 што ги активира дендритичките клетки со активирање на рецептори за напредни крајни производи за гликација, рецептори TLR4, TLR7 и TLR9. 44 Покрај тоа, некротичните клетки можат да тренираат ЦД4 + Т-клетки, кои се неопходни за развој на адаптивен имунолошки одговор. 45 Можноста адаптивниот имунолошки одговор да биде активиран од некроза предизвикана од СМ83 е зголемен од нашите резултати при користење на имунокомпетентни глувци BALB/c со асцити на мет-А. Некои од овие глувци биле излекувани со третман со СМ83 и не развиле понатаму асцит кога биле изложени на нова двојна доза на клетки на Мет А, што сугерира дека тие биле имуни на клетките на сарком Мет А.
Сумирајќи, нашите податоци покажуваат дека SM83 е активен во монотерапија со промовирање на воспаление и смрт на имуногени клетки. Овие набудувања даваат објаснување зошто СМ ја зголемува ефикасноста на стандардните терапии преку стимулирање на имунолошкиот систем. Конечно, доказите дека СМ можат да предизвикаат воспалителен одговор и да го активираат имунолошкиот систем даваат толкување зошто СМ може да биде поефикасен in vivo отколку ин витро, 11, 46 и нашите резултати во убиството на клетките на ракот.