Теза. Поднесен за да се добие диплома по биологија на Биолошкиот факултет на Рурскиот универзитет Бохум
Дипломска теза е доставена за да се добие диплома по биологија на Факултетот за биологија на Универзитетот Рур Бохум Анализа на екстрактибилните и неекстрахибилните остатоци од сулфадијазин и неговите метаболити три години по примената на ѓубриво од свињи на лизиметри и ремобилизација на остатоците што не се вадат преку активност на ризосферата на пченка. Подготвено од Вибке Шулте-Хунсбек во физичка географија/наука за почва/екологија на почва на Факултетот за геоуки Бохум, во септември. 2009 Говорник: Проф. Др. Ко-судија на Бернд Маршнер: Проф. Доминик Бегероу
Оваа дипломска работа е создадена во пријателска соработка со Форшунгсцентрум Јулих ГмбХ, член на Здружението на германски истражувачки центри Хелмхолц. Институт Агросфера МКГ 4 Forschungszentrum Jülich GmbH 52425 Jülich (зграда 16,6) Раководител на институтот: Проф. Хари Верикен контакт на лице место: Др. Јоуст Гроневег
Декларација Со ова изјавувам дека ја напишав дипломската работа доставена денес независно и дека не користев други извори и помагала освен дадените и дека имам обележано цитати. Оваа дипломска работа се состои од четири примероци кои се сосема идентични по збор и по слика. Јас исто така изјавувам дека дигиталните слики ги содржат само оригиналните податоци и дека не е извршена никаква обработка на слики за промена на содржината. Супервизор на тезата беше: Проф. Бернд Маршнер Како ко-судија, предлагам: проф. Доминик Бегеров Бохум, (наслов)
Содржина Содржина Список на фигури Список на табели Список на кратенки и симболи 1! Вовед. 13! 1,1! Сулфадијазин. 15! 1,2! Литературна критика. 16! 1.2.1! Транспорт на супстанции во земјата. 16! 1.2.2! Сорпција во почвата. 19! 1.2.3! Остатоци што не се вадат. 24! 1.2.4! Превоз на SDZ во фабриката. 25! 1.2.5! Распаѓање на СДЗ во почвата. 26! 1.2.6! Деградација на SDZ Фотохемиски. 27! 1.2.7! Деградација на СДЗ кај цицачи. 28! 1.3! Поставување на цел. 30 2! Материјал и методи. 31! 2,1! Опис на пробните подови. 31! 2,2! Лизиметар. 33! 2.2.1! Тест лизиметар. 35! 2.2.2! Историја и почетен статус на тест лизиметри. 36! 2,3! Карактеризација на супстанцијата за испитување. 37! 2,4! Методи. 38! 2.4.1! Земји за земање примероци. 38! 2.4.2! Подготовка на примероци од почва. 39! 2,5! Придружни параметри. 40! 2.5.1! утврдување на вредноста на ph. 40! 2.5.2! Одредување на влага во почвата. 40! 2,6! Екстракција на почва. 41 ! 6-ти!
Содржина 2,7! Екстракција на цврста фаза. 43! 2,8! Проба на растенијата. 45! 2.8.1! Експериментално поставување. 45! 2.8.2! Растенија за земање примероци. 47! 2,9! Аналитички методи. 48! 2.9.1! Оксидатор. 48! 2.9.2! Мерење на LSC. 50! 2.9.3! LC-MS/MS. 51! 2.10! Евалуација. 54 3! Резултати. 56! 3,1! Експерименти со лизиметар. 56! 3.1.1! 0,5 м! -Тестови на лизиметар. 56! 3.1.2! 1 м! -Лизиметар. 68! 3,2! Проба на растенијата. 74 4! Дискусија. 83! 4,1! Лизиметар. 83! 4.1.1! Придружни параметри. 83! 4.1.2! Балансирање на SDZ во лизимерите. 85! 4.1.3! Секвенцијална анализа на екстракција и метаболит. 90! 4.1.4! Сорпција на SDZ. 94! 4,2! Проба на растенијата. 97! 4.2.1! Придружни параметри. 97! 4.2.2! Ремобилизација на секвестрираниот SDZ преку активност на ризосфера. 98! 4,3! Резиме. 100 5! Библиографија. 101! 6! Додаток А. 106 ! 7-ми!
Содржина Таб. 20: Еквивалентна концентрација (c eq) на SDZ [mmol g -1] на секвенцијалното извлекување од примероците на почвата од тестот за лизиметар и тестот за садење A2 (Kal) и B2 (Mer). 81! Таб. 21: Концентрација на SDZ и неговите метаболити [mmol g -1] на ацето. + H 2 O екстракција на почвени примероци од експериментот со лизиметар и експериментот за садење A2 (Kal) и B2 (Mer). 82! Таб. 22: Еквивалентно количество (A eq) на SDZ [mmol] на последователното извлекување од примероците на почвата со лизиметар А1 (Кал) до длабочина од 30 см на денот на земање мостри 29, 120, 218, 1022. 106! Таб. 23: Еквивалентно количество (EQ) на SDZ [mmol] на секвенцијалното извлекување од примероците на почвата со помош на лизиметар Б1 (Mer) до длабочина од 30 см на денот на земање мостри 29, 120, 218, 1022. 107 ! 11!
Содржина Список на кратенки и симболи Кратенка Активност на APG на 4-OH-SDZ 4-хидроксисулфадијазин по грам почва [Bq g -1] Еквивалентно количество eq [mmol] Ацето. Acety-SDZ BBA c eq Ацетонитрил Н-ацетил-сулфадијазин Упатства за тестирање на производи за заштита на растенија и опрема за заштита на растенија еквивалентна концентрација [mmol g-1] ДНК Деоксирибонуклеинска киселина FZJ Forschungszentrum Jülich GLP Добра лабораториска практика HPLC Chist K/B Kick/Brauckmann бродови k OC LC-MS/MS LSC Mer MRSA MS NER PKs Коефициент на сорпција (n = пријателски за органски јаглерод) течна хроматографија заедно со тандем масена спектрометрија Бројач на течна сцинтилација Мерзенхаузен мултирезистентен Staphylococcus aureus соеви масен спектрометар не-екстракт негативен декаден логаритам на киселинската константа K s! Густина [g cm - "] SDZ Sulfadiazine СОП Стандардни упатства за работа SPE Екстракција на цврста фаза СЗО Светска здравствена организација Wk максимум Максимален капацитет за задржување на водата [%]! 12!
Вовед SDZ Transport во почвата Студиите за транспорт со SDZ покажаа дека различни резултати доведуваат до примена на SDZ со вода или со течно ѓубриво. Ако СДЗ се нанесува заедно со течно ѓубриво, истрагите на Буркхард и сор. (2005), Кеј и др. (2005) и Блеквел и сор. (2007) таа кашеста маса го фаворизира површинскиот одлив на SDZ. Истражувањата покажаа дека течното ѓубриво, поради неговата цврста содржина, ги затвора ситните пори на почвата и со тоа СДЗ исцедува побрзо од другите антибиотици (Буркхард и сор., 2005). Видот на почвата не е важен овде; брзото истекување на површината е забележано и во глинени почви (Блеквел и сор., 2007) и во песочни почви (Кеј и сор., 2005). Кога SDZ се нанесува со течно ѓубриво, SDZ влегува во почвата преку повластен проток, меѓу другото, како што покажаа студиите од Буркхард (2007). 18-ти!
Наместо тоа, иницирајте ја неговата концентрација. Колку е поголема пропорцијата на јон во растворот на почвата, толку е поголема неговата пропорција во јонскиот слој (Шредер и Блум, 1992). Внатрешно-сферичниот комплекс на SDZ се базира на формирање на комплексни соединенија и ја обезбедува специфичната сорпција. Молекулата или јонот на почвениот раствор делува како лиганд и поместува лиганд координиран околу централниот атом на металниот јон. Поради формирање на ковалентни врски помеѓу лигандите, овие внатрешно-сферични комплекси се многу стабилни (Шефер и Шахтшабаел, 2002). Сл. 3: Сорпција на катјоните на минерална површина на оксид или глина со променлив полнеж (Sigg & Stumm 1994 Aquati Chemistry, Teubner, Stuttgart).! 21-ви!
Воведувањето на јаглерод диоксид треба да се исклучи. Само учеството од 2% во вкупната дадена сума беше проценето како 14 CO 2. Ова покажува дека СДЗ може да се распадне само многу бавно во почвата. Во сегашните истраги, може да се дадат изјави за производи за деградација, при што беа идентификувани 4-OH-SDZ, Formyl-SDZ и 4- (2-минопиримидинил-1 (2H)) анилин (меѓу другото: Sukul et al., 2008). 1.2.6 Фотохемиска деградација на SDZ Деградацијата на SDZ од сончева светлина (УВ зрачење) е чисто механизам за абиотичка деградација. Фотолитичката деградација беше меѓу другите од Сукул и сор. (2008) и Волтерс и Стефенс (2005). Ако SDZ се нанесува со кашеста маса, тој е подложен на УВ зрачење подолго. Оваа патека на распаѓање за SDZ е можна само во ограничена мера во почвите. Фотохемиската деградација силно зависи од вредноста на р, а со тоа и од околните компоненти. Во случај на фотохемиска деградација, доминира индиректната фотолиза (Волтерс и Стефенс, 2005). Компонентите возбудени од светлината кванти можат да ја пренесат оваа стимулација на SDZ и со тоа да го стимулираат да се распадне. Фотосензитивни супстанции можат да предизвикаат зголемување на фотодеградацијата, на пример, водороден пероксид, хумински киселини, фулвични киселини и ацетон (Sukul et al. 2008).! 27!
Вовед 1.2.7 Деградација на СДЗ кај цицачи За време на биотрансформацијата на СДЗ кај свињите, се излачува 96% од администрираниот СДЗ означен со 14 С. Ова значи дека само 4% е проголтано од животното. Биотрансформацијата на СДЗ кај свињите е опишана од Ламшафт и сор. (2007) детално испитана. Радиоактивно обележаната SDZ (14 C-SDZ) се хранела со свињи четири дена и нивните екскрети (ѓубриво) се собирале дневно во период од 10 дена по администрацијата. Собраните примероци од кашеста маса беа анализирани за SDZ и неговите метаболити. 44% од СДЗ се излачува заедно со главните метаболити. Најдени главни метаболити биле ацетил-СДЗ (21%) и 4-ОХ-СДЗ (26%). Други секундарни метаболити беа N-формал-сулфадијазин (0,1%) и N-ацетил-4-сулфадијазин (1,8%). Максималната екскреција се случи на шестиот ден по администрацијата. При распределбата на активноста во рамките на ѓубривото, 80% биле пронајдени во цврста материја и 20% во течна фаза. На слика 7 се прикажани производите на деградација на СДЗ кај свињите. Сл. 7: Деградација на 14 C-SDZ преку биотрансформација, (* = локација на ознаката 14 C) (Lamshöft et al., 2007).! 28!
Вовед Распаѓањето генерално се одвива кај цицачи во две фази. Во првата фаза, ензими како што се Монооксигеназата и редуктазата ги раздвојуваат функционалните групи или, како и кај хидролазата, се прицврстуваат функционалните групи (-OH). Во втората фаза, добиениот метаболит е поврзан со ендогена, растворлива во вода супстанција. Ова ја зголемува растворливоста во вода на супстанцијата што се распаѓа и може полесно да се излачува. SDZ се елиминира главно преку бубрезите и само во мала мера преку црниот дроб и цревата (Sukul and Spiteller; 2006). SDZ целосно се претвора во форма на SDZ во ѓубриво од метаболити (Langhammer, 1989). Таб. 3: Карактеризација на двата главни метаболити 4-ОХ-СДЗ и ацетил-СДЗ 4-хидроксисулфадијазин Н-ацетил-сулфадијазин (4-ОХ-СДЗ) (ацетил-СДЗ) збирна форма C 10 H 11 N 4 O 3 SC 12 H 14 N 4 O 4 S моларна тежина 267,27 g/mol 310,32 g/mol! 29!
Материјал и методи Калденкирхен (Кал) Браунерде Н: 51 18 25 О: 6 12 12 Мерзенхаузен (Мер) Парабраунерде Н: 50 55 50 О: 6 17 47 Сл. 8: Преглед на локациите на теренот: Мерзенхаузен (Мер) и Калденкирхен (Кал) во NRW.! 32!
Материјал и методи Слика 9: Шематски цртеж на надворешниот лизиметарски систем на ICG-4 со вдлабнат аголен 1 m! Монолит на подот (Pütz, 1993) 34!
Материјал и методи 2.3 Карактеризација на испитната супстанција ѓубривото што се користи за овој експеримент од експериментите за хранење, како што е опишано од Ламшафт и сор. (2007) Дел 1.2.7. Користениот 14 C-SDZ со 99% чистота имал специфична активност од 8,6 MBq mg -1 и е произведен од Bayer AG, Wuppertal. SDZ беше радиоактивно обележан на 2C атом на анилинскиот прстен (14 C-SDZ), видете слика 11. 14-та ознака СДЗ беше измешана со неозначена SDZ во однос 1:20 (w/w). Необележаната SDZ беше испорачана од Флука, Зелзе. Радиоактивно обележана SDZ (14 C-SDZ) се хранат со две свињи. Паралелно, неозначена SDZ беше администрирана орално кај две други свињи во рок од 4 дена. Theивотните кои добиле 14 C-SDZ добиле вкупна доза од 540 mg d -1 (928,8 MBqq). Ова одговара на 30 mg kg -1 d -1 телесна тежина. Theивотните кои добиле неозначена SDZ добиле вкупна доза од 570 mg kg -1 d -1 телесна тежина. Примероците на течно ѓубриво собрани дневно во период од 10 дена беа анализирани со помош на детекција на 14 C. Сл. 11: 14-сулфадијазин означен со C (14 C-SDZ) (* = локација на означувањето со 14 C) (Lamshöft et al. 2007) 37
Материјал и методи 2.4.2 Подготовка на примероци од почва За следните анализи, земјата се просеа на 2 мм и се пренесе во ПЕ вреќи. PH вредноста и влагата на почвата потоа беа утврдени во полето-влажна почва. За понатамошни анализи, почвата се исуши на 105 ° C до постојана тежина. Потоа, приближно 200 g беа хомогенизирани со планетарна мелница (Retsch PM4) (15 мин на 250 вртежи во минута; Förster et al., 2009). Во случај на планетарна мелница, центрифугалната сила го притиска земјата материјал (примерок од почва) со мелење топчиња (пет парчиња) на wallидот на теглата за мелење и со тоа го дроби со триење. Шематски приказ на работните чекори може да се види на Слика 12. Свежа почва на теренот на 2 мм седум придружни параметри (вредност на рН, влага во почвата) -сушење -хомогенизирање-екстракција на почвата -Оксидизатор-анализа на LSC -LC-MS/MS Слика 12: Табела на проток на работните чекори за обработка на примерокот на почвата.! 39!
Материјал и методи 2.5 Придружни параметри 2.5.1 Определување на вредноста на pH вредноста на ph се определува врз основа на DIN ISO 10390. Вредноста на ph се одредува во суспензија на раствор на почва и калциум хлорид (0,01 M) по едночасовно време на изложеност со повремено мешање со ph метар. Мерачот на р е калибриран со стандардните тампонски решенија ph 4 и ph 7 пред употреба (Blume et al. 2000). Услови за анализа Извршени се три повторувања по слој на почвата. ph-метар: Метлер Толедо 1120X Мерење: 10 g суво тло на воздухот реагенс: 25 ml 0,01 M раствор на калциум хлорид 2.5.2 Определување на влага во почвата Влагата на почвата е еден од наједноставните параметри за опишување на условите на водата на почвата. Влажноста на почвата не се мери директно, туку индиректно, гравиметриски, преку заобиколување на тежината. Свежата и влажна почва се мери и суши до постојана тежина. Одредувањето на влагата во почвата се врши врз основа на DIN ISO 11465 (1996-12). Влагата на почвата се дава во однос на влажната маса на почвата во% по маса. Услови за анализа Извршени се три повторувања по слој на почвата. Сува скала: Метлер Толедо HB43-S Тежина на халоген: 0,3 g-2 g почва! 40!
Материјал и методи Таб. 6: Шематски редослед на последователна екстракција според Förster et al. (2009). Мерење на: 10 g почва во центрифугирани цевки Екстракција на CaCl 2 екстракција на CaCl 2 Екстракција на Me-OH Aceto.-H 2 O -Реагенс: 25 ml, 0,01 М раствор на CaCl 2 -24 часа тресење над глава -центрифугација * -декантација -мерење на Измерете го супернатантот -1 ml во LSC (сцинтилатор: 10 ml Ultima Gold) - реагенс: 25 ml, метанол -4 часа тресење над глава - центрифугирање * -дектантирање - измерете ја супернатантна мерка -2 ml во LSC (сцинтилатор: 10 ml Instagel) - варење на микробранова печка -Реагенс: 50 ml 1: 4 (v: v) ацетонитрил: вода! Земете 20 ml од суспензијата со растворувач во почва -Центрифугирање ** -декантирање -мерење на супернатантна мерка -1 ml во LSC (сцинтилатор: 10 ml Instagel)! Остаток од екстракт -центрифугација * -дектантирање -мерење на супернатантот -дискортирање на супернатантот се исуши дното во цевките за центрифугирање за подоцна да се запали во оксидаторот *: Алегра 6KR, 30 мин на 900 * g **: J2-21 HS, 30 мин на 40.000 * g! 42!
Материјал и методи Таб. 7: Работни чекори за прочистување на екстрактите од CaCl 2 со употреба на SPE. Чекор Волуменски реагенс 1 3 ml метанол 2 3 ml 5:95 метанол: дестилирана вода 3 3 ml дестилирана вода Вода 4 X * CaCl 2 екстракт 5 20 ml оддалеченост. Вода 6 Исушете го кертриџот 15мин 7 3 ml метанол Закиселен на pH2 *: Екстрактот од CaCl 2 се соедини пред да се нанесе на колоната, 1 ml се отстрани и се мери во LSC. Остатокот се мери и центрифугира (30 мин на 40 000 * g; J2-21HS). Супернататот се нанесува на колоната. Услови за анализа SPE колона: Oasis HLB 6 cc-200 mg (Waters Oasis) Вакуумска пумпа: Vacumbrand SPE приврзаност: SPE-24G Киселина за закиселување: 200 μl мравја киселина! 44!
Материјал и методи Сл. 13: Експериментално поставување на експериментот за садење (поглед: растенија со пченка во садови Кик/Браукман под клупата за одгледување на растенија) Садови за кик/Браукман: 16 парчиња (Ø = 22 см) Комплетно ѓубриво: приближно 3 гр сино зрно (ENTEC, КОМПО) Јадра од пченка: 12 парчиња PR39K13 (Рана Starвезда, Бајано) Скала: Метлер Толедо G5002-2 Сува скала: Метлер Толедо HB43-S халоген Друго: алуминиумска фолија, мерна чаша, рачна лопата, правило за преклопување! 46!
Материјал и методи 2.8.2 Постројки за земање примероци Експериментот заврши по околу 80 дена. Вкупната тежина на поставувањето на тестот, тежината на садовите Kick/Brauckmann, надземните (стебла и лисја) и подземните делови на растенијата и тежината на почвата се евидентирани. Ризосферата била изложена само приближно со дробење на трошките со прстите. Почвата беше одвоена од преостанатите мали и фини корени со просејување (