Улогата на фосфолипидите и оксидираните липиди во обработката на претходникот на амилоидот

Од областа на експериментална неврологија, теоретска медицина и биолошки науки на Медицинскиот факултет на Универзитетот во Саарленд Хомбург/Саар Важноста на фосфолипидите и оксидираните липиди за обработка на протеинот претходник на амилоид (АПП) и дисертација на Алцхајмеровата болест за да се добие докторат Природни науки на Медицинскиот факултет на УНИВЕРЗИТЕТ САРЛАНД 2016 презентирани од Виола Ј. Хауптентал родена на 24.08.1982 во Сарбрикен

улогата

(3.2.9) Определување на активноста на α-секретаза и АДАМ-10 по ин витро инкубација 25 (3.2.10) Определување на содржината на Aβ, сапβ и сапа. 26 (3.2.11) Определување на содржината на ADAM-17, BACE-1 и PS-1. 27 (3.3.) Анализа на липиди. 28 (3.3.1) Екстракција на липиди од човечки мозоци по смртност. 28 (3.3.2) Мерење на стабилноста на DHA. 28 (3.3.3) Определување на содржината на липиди со масена спектрометрија. 28 (3.3.4) Определување на содржината на фосфолипиди со помош на тенок слој хроматографија. 29 (3.3.5) Определување на содржината на HNE. 30 (3.3.6) Одредување на липидна пероксидација. 30 (3.4) РНК анализа. 31 (3.4.1) Изолација на РНК. 31 (3.4.1) cdns синтеза и реално време полимеразна верижна реакција (RT-PCR). 31 (3.5) Статистичка проценка. 32 (4) публикации. 33 (4.1) Резиме на публикацијата 1 и опис на партиципацијата. 33 (4.2) Резиме на публикацијата 2 и опис на партиципацијата. 69 (4.3) Резиме на публикацијата 3 и опис на партиципацијата. 87 (5) Проширено резиме. 102 (5.1) Липиди во АД. 102 (5.2) Во контекст: фосфолипиди, DHA и оксидирани липиди во обработката на АПП и нивната улога во АД. 104 (6) Резиме и изгледи. 117 (7) Учество во други публикации. 119 (8) Библиографија. 121 (В) Признанија. 133

Кратенки (Б) Кратенки С степени Целзиусови μm микро моларен АА арахидонска киселина Аβ амилоид β АД Алцхајмерова болест ADAM α-секретаза А-дезинтегрин-и-металопротеаза AICD интрацелуларен АПП-домен Aph engl. Преден фаринкс-дефектен АПО Е аполикопротеин Е АПП амилоид претходник на протеин БАЦЕ β-секретаза БСА говеден серумски албумин COX циклооксигеназа CTF Ц-терминален домен на АПП ДХА докозахексаеноична киселина ДМЕМ Дублеко модифициран орел медиум ДНК деоксириботенуклеична ензимска ензимска ензимска ензиоетоинуелексиева киселина Етилен гликол тетраоцетна киселина EOAD Рана форма на Алцхајмерова болест EPA Eicosapentaenoic acid FAD Фамилијарна форма на Алцхајмерова болест FCS Фетален телесен серум g/g грам/забрзување поради гравитација GSK3β Гликоген синтаза киназа 3 часа HBSS солен раствор на раствор на примарни неврони 3 H 3-метилглутарил коензим А редуктаза 5

Кратенки HNE 4-хидроксиноненална HPLC течна хроматографија со високи перформанси IDE Инсулин деградирачки ензим IP имуноципитација LDH мерење на лактат дехидрогеназа LDL липопротеин со мала густина LOAD Доцна форма на Алцхајмерова болест LOX липоксигеназа LRP1 липопротеин рецептор N-N 40-минутен раствор N-N 40% 1 Невропротектин-Д1 NTF неврофибриларен заплеткува оптичка густина на OD P-вредност, ниво на значење PBS фосфат-пуфер солен раствор компјутер фосфатидилхолин PE фосфатидилетаноламин плазмалоген ПС фосфатидилсерин PSEN engl. Засилувач на презенилин RIP регулирано интрамембранска протеолиза RNS рибонуклеинска киселина RT собна температура RT-PCR полимеразна верижна реакција SAD спорадична форма на Алцхајмерова болест растворлива во APP и втора SSD натриум додецил сулфат PAGE полиакриламид гел електрофореза СПТ серински палмитоил-коаензим вајт-теабезим-ваензими

Вовед Откако ќе се исече α-секретазата, амтф-врзаниот мембрана се распарчува од γ-секретазата, кој го ослободува малиот фрагмент p3 во цитозолниот AICD и вонклеточно. За разлика од амилоидогената патека, AICD од не-амилоидогениот пат се разградува во клетката, меѓу другото, и инсулинскиот деградирачки ензим (IDE), поради што транскрипционата важност на овој AICD е контроверзна (Белјаев и сор. 2010). Функцијата на p3 е сè уште нејасна. Преглед на обработката на APP е прикажан на слика 1. Слика 1 Шематски приказ на обработката на APP, изменета од (Grimm, Rothhaar & Hartmann 2012). Неамилоидогената обработка, прикажана погоре десно, ја презема α- (зелена) и γ-секретаза (сина). Првично се формираат растворливиот сапа α и мембрано-базираниот αctf. Потоа се формираат p3 и AICD. Aβ е означено со црвена боја во рамките на APP. Амилоидогената обработка е прикажана лево долу. Б-секретазата ја сече АПП што резултира со сапβ и βctf. Потоа Aβ и AICD се ослободуваат од γ-секретазата. 16

Публикации на липиди во клетките и изолирани мембрани, што ги спроведе С. Гросген (слика S5), ги извршив инкубациите на липидите. За одредување на содржината на PC, PE и PS со тенок слој хроматографија, спроведена од B. Hundsdörfer (слика S2) и утврдување на липидниот профил, спроведена од S. Grösgen (табела S5), имам мембрани од SH -Изолирани SY5Y клетки и човечки постмртни мозоци. Јас ја извршив статистичката анализа на податоците користејќи ANOVA во соработка со В. Цимер и Le.Леман (слика 1-4, табела S1-4). Публикацијата 1 може да се најде подолу. Оригиналот на публикацијата може да се најде на веб-страницата на издавачот MDPI AG (Базел, Швајцарија), www.mdpi.com/journal/ijms, под бројот дои: 10.3390/ijms14035879. 35

Додаток Ротхар и со други публикации Сл. С1 Цитотоксичност по инкубација на липиди Сл. С2 Контрола на специфичноста во анализата на -секретаза Сл. С3 Контрола на специфичноста во цитотоксичноста на анализата на секретазата 5 4 3 2 1 [%] н.с. н.с. флуоресценција (активност на секретаза) [RFU] контрола + инхибитор на секретаза флуоресценција (активност на секретаза) [RFU] контрола + инхибитор на секретаза PC 22: 6 PC-PL 22: 6 PE 22: 6 PE-PL 22: 6 0 2000 4000 6000 8000 време [сек.] 0 1000 2000 3000 4000 5000 време [сек.] Сл. S4 Контрола на специфичноста во флуоресценцијата на анализата на секретаза (активност на секретаза) [RFU] контрола + инхибитор на секретаза 0 2000 4000 6000 време [сек] 86

Публикации Во прилог на анализата во живите клетки, извршив инкубација на мембрани од SH-SY5Y клетки и последователно мерење на активноста на β-секретаза и ги проценував податоците статистички (Слика 2в). Определувањето на експресијата на секретазите беше спроведено од Met. Мет по мојата инкубација на клетките со оксидирани липиди (слика 2 г). T. Blümel ја утврди активноста на β- и γ-секретаза по инкубација со DHA (резултати во текстот) и C. Stahlmann DHA стабилност (резултати во текстот); Ја извршив инкубацијата со липиди и за двете анализи. Статистичката евалуација на нивото на Аβ по инкубација со DHA и оксидирани липиди беше спроведена од Н. Милонас (резултатите во текстот). Публикацијата 3 може да се најде подолу. Оригиналот на публикацијата може да се најде на веб-страницата на издавачот S. Karger AG (Базел, Швајцарија), www.karger.com/ndd, под бројот дои: 10.1159/000440839. 89