Употребата на администрација на орофаринксот во интратрахеална PAMP и бронхоалвеоларната лаважа до

Резиме

Имунолошкиот одговор на домаќинот на патоген инфекција е строго регулиран процес. Со помош на липополисахариден модел на изложеност на белите дробови кај глувци, можно е да се направат проценки со висока резолуција на сложените механизми поврзани со развојот на болеста.

Апстракт

Вовед

Опишаните протоколи се многу флексибилни и лесно може да се модифицираат за да се процени широк спектар на PAMP и поврзаното оштетување на молекуларните обрасци (атенуирани). Покрај тоа, со неколку дополнителни модификации, овие протоколи може да се применат и на студии кои покажуваат прогресија на алергиска респираторна болест или интеракции на домаќин-патоген со живи бактерии, вируси или габи 5-10.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Целото истражување е спроведено под одобрение на Комитетот за институционална грижа и употреба (IACUC) за Вирџинија Техн и во согласност со Националниот водич за здравство за грижа и употреба на лабораториски животни.

1. Интратрахеална (и) инокулација на ЛПС со орофарингеална администрација

2. Колекција на серумска и бронхоалвеоларна лаважа (BAL)

900 μl во душникот, надувување на белите дробови и веднаш повлекување на HBSS. Ставете го задниот БАЛФ во конусна цевка од 15 ml.

  • Повторете ја оваа лаважа уште 2 пати за да соберете приближно 3 ml BALF за идна анализа. Чувајте го БАЛФ на мраз или на 4ºС додека не се користи.

    • 3. Подготовка за хистопатологија

    1. Центрифугирајте ја целата крв собрана во чекор 2,5 на 12 000 xg за 5 мин за да се изолира серумот. Серумот во претходно обележана микроцентрифугална цевка од 1,5 ml и се чува на -80 ° C
    2. Проценете ги серумските нивоа на цитокини со ЕЛИСА или сличен тест. Разредете го серумот од 1,05 до 1,20 во соодветен пуфер за разредување во зависност од анализата според упатствата на производителот. Овие разредувања треба да се утврдат емпириски пред да се извршат мнозинството примероци.
    3. Поради малиот волумен на добиен серум, намалете го волуменот на примерокот на плочата ELISA со половина натоварена. На пример, повеќето комерцијални ELISA користат 100 μl волумен на стандарди и примероци. За да заштедите примероци, наполнете 50 μl стандарди и разреден серум по бунар.
    4. Центрифугирајте го BALF во врвна центрифуга во ладилна клупа на 200 g за 5 мин. Пренесете го суперинатанот без клетки во две претходно обележани микроцентрифугални цевки од 1,5 ml и чувајте ги на -80 ° C
    5. Проценете БАЛФ цитокини со ELISA или сличен тест без разредување.
    6. Неискористен серум и БАЛФ на -80 ° C

    5. Диференцијално боење и проценка на мобилноста на БАЛ

    6. Евалуација на хистопатологија

    1. Подгответе ги белите дробови за проценка на хистопатологијата. По 24-48 часа фиксација на формалин, сите надуени бели дробови се ориентираат вентрално и се вградени во парафин. Исечете ги блоковите за да ги откриете добиените главни патеки на потокот.
    2. За да се подобри точноста на бодувањето, поставете ги белите дробови во иста позиција и исечете го секој блок, што резултира во максимална надолжна визуелизација на главните интрапулмонални аксијални дишни патишта. Од оваа точка исечете 5 микрони сериски делови и дамкајте со хематоксилин и еозин (H&E). Дополнителни делови може да се исечат и подготват за хибридизација на самото место со користење на стандардни протоколи.
    3. Проценете ја хистопатологијата користејќи полу-квантитативен систем за проценка заснован на следниве воспалителни параметри, кои се оценуваат помеѓу 0 (отсутни) и 3 (тешки): мононуклеарна и полиморфонуклеарна инфилтрација на клетките; Хиперплазија и повреда на клетките на епителните клетки на дишните патишта; Екстравазација; периваскуларни и перибронхеоларни pиркања; и процентот на белите дробови вклучени во воспаление. Хистопатологијата на белите дробови треба да ја процени искусен патолог.
    4. Просечно сите вредности на параметрите за да се генерира севкупен резултат на хистопатологија или да се користат индивидуални резултати за да се измерат специфични аспекти на прогресијата на болеста. Направете сите бодови на двојно слеп начин, со рецензенти заслепени и за генотипот и за третманот. Системот за бодување беше претходно опишан 6,7,10.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    Администрацијата на ЛПС предизвикува високи нивоа на локални и системски про-воспалителни медијатори, вклучително и неколку цитокини поврзани со вродениот имунолошки одговор. Локалните нивоа на цитокини во БАЛФ се проценуваат со употреба на конвенционални техники како што е ЕЛИСА. Заеднички цитокини кои се регулираат во белите дробови по администрација на LPS вклучуваат TNF-α, IL-1β и IL-6 (Слика 2А). Системски нивоа на цитокини во серумот со користење на истата техника како и проценките на BALF (2 Б) опишани, проценети. Не е невообичаено некои медијатори да бидат присутни во локалната микросредина, но да бидат присутни во серумот. На пример, TNF-α рутински се наоѓа на високо ниво во белите дробови по LPS, но обично не се открива системски под условите опишани во овој протокол (Слика 2А и 2 Б; под границата на откривање).

    pamp
    2. Респираторната изложеност на ЛПС доведува до зголемено ниво на локални и системски цитокини. А) По изложеноста на ЛПС, локалните нивоа на широк спектар на проинфламаторни цитокини може да се забележат во БАЛФ во текот на првите 24 часа, вклучително и TNF-α, IL-1β и IL-6. Овие цитокини може да се проценат со ЕЛИСА, како што е прикажано овде, 24 часа по изложеноста на ЛПС. Б) Неколку цитокини исто така може да се детектираат системски во серумот. Сепак, постојат некои исклучоци, вклучително и TNF-α, кои се наоѓаат во високи концентрации во БАЛФ во серумот, но не. Цитокините од интерес за серумот треба да се проценат емпириски пред да се изврши евалуација од големи размери. Кликнете овде за поголем преглед .

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Клучните чекори за успешно проценување на имунолошкиот одговор во белите дробови на глувчето се како што следува: 1) изберете ги соодветните видови на глувци и полот за моделот што се проценува; 2) оптимизирање на ПАМП испорака до белите дробови; 3) правилно собирање и обработка на БАЛФОТ; и 4) правилно фиксирање и подготвување на белите дробови за хистопатолошки проценки.

    Утврдено е дека администрацијата на орофаринксот е поточна од другите форми на испорака на лекови до белите дробови 2. Ова во најголем дел се должи на директен пристап до дишните патишта и заобиколување на проблемите поврзани со назално и максиларно таложење. Сепак, како и со сите тестирања врз животни, за тоа е потребна голема рачна вештина и пракса за да се постигне знаење за управување. Неточна техника може да резултира со неефикасно белодробно крило, а во некои случаи и со повреда на животно. Типично, Evans Blue Dye (EBD) може ефикасно да се користи или како алатка за обука за оваа постапка или за решавање проблеми на можните проблеми поврзани со депозитот 4. ЕБВ може да се администрира, а потоа да се извлече од ткивото со употреба на формамид. Количината на EBD може да се пресмета со користење на нивоа на апсорпција во споредба со стандардна крива. Во наши раце, типичното закрепнување на EBD се движи помеѓу 90-98%. Се вели дека повеќето од не апсорбираната боја се поврзани со истекување во хранопроводот. Заради нејзината точност, технологијата за администрација на ИТ е идеална за доставување на различни супстанции чувствителни на дозата до белите дробови, како што се активни фармацевтски состојки или инфективни организми.

    t "> Оваа постапка е оптимизирана за испорака на LPS и други PAMP во белите дробови на глувците. Откако овие техники ќе се совладаат, дополнителни истражувања исто така може да се активираат со модифицирани протоколи за ефективно да се оценат интеракциите на домаќинот-патогенот со живите патогени. Исто така, и тука Опишаните техники се многу разноврсни и можат да се користат за кој било интерес на студијата за проценка на клиничката и физиолошката важност на експериментално или фармацевтско средство. Поради точноста на дозата, оваа техника е исто така идеална за in vivo испитувања за кои се потребни високи нивоа Прецизност при испорака на средства.

    Оваа постапка е оптимизирана за испорака на LPS и други PAMPs до белите дробови на глувците. Откако ќе се совладаат овие техники, може да се активираат и дополнителни студии со употреба на модифицирани протоколи за ефикасно проценување на интеракциите на домаќинот-патогенот со живите патогени. Исто така, опишаните техники тука се многу разноврсни и можат да се применат на секоја студија заинтересирана за проценка на клиничката и физиолошката важност на експерименталното или фармацевтското средство. Поради точноста на дозата, оваа техника е потребна и за ин виво студии за кои е потребен висок степен на точност при испорака на активни супстанции.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Откривање

    Авторите наведуваат дека нема конкурентни финансиски интереси.