Енодермален, хепатален потенцијал за диференцијација
1 Енодермален, хепатален потенцијал за диференцијација на возрасни и ембрионални матични клетки in vitro и in vivo презентирани од дипломираната биотехнологија Аника Вулф-Голденберг од Берлин од Факултетот за процеси на факултет III на Техничкиот универзитет во Берлин за да се добие академска диплома доктор по инженерство - д-р. Инг - Одобрена дисертација Докторски комитет: Претседател: Проф. Дипл. -Инг. Д-р Репортер на У. Стал: Проф. Репортер на Р. Лаустер: Др. хабил И.Фихтнер известувач: проф. Д-р. J. Kurreck Ден на научна дискусија: 30 март 2010 година Берлин 2010 D 83
2 Гледаш, Момо, рече уличниот чистач Бепо, вака е: Понекогаш ве чека многу долг пат. Мислите дека е толку ужасно долго; никогаш не можете да го направите тоа, мислите. И тогаш почнуваш да брзаш. И, се брза се повеќе и повеќе. Секој пат кога ќе погледнете нагоре, ќе видите дека нема ништо помалку од тоа што претстои. И повеќе се обидувате, се плашите и на крајот ви останува без здив и не можете повеќе. И патот е сè уште пред вас. Не можете да го направите тоа така. Никогаш не треба да размислувате за целата улица одеднаш, знаете? Треба само да се размисли за следниот чекор, потоа следниот здив, следниот удар на метлата. И секогаш само до следната. Тогаш е задоволство; тоа е важно, тогаш добро си ја работиш работата. И така треба да биде. Одеднаш сфаќате дека сте го направиле целиот пат чекор по чекор. Вие дури и не забележавте како и не застанувате од здив. Ова е важно. Мајкл Енде, од Момо За моите родители, затоа што ме научи да одам по мојата улица со храброст и доверба.
5 S u m e n g e s u n t 5 од клетките. Сепак, не беше постигната јасна диференцијација во функционален хепатоцит. Избраните услови на индукција на ин витро диференцијација на условениот медиум и на кокултурата им овозможија на ЦД34 + клетките малку да се разликуваат во хепатални ендодермални клетки. Енодермалната хепатална диференцијација може да биде предизвикана во човечките ембрионални матични клетки од линијата SA002 од страна на ин витро системите. Избраните ин витро услови покажуваат дека директен контакт во ко-културата може да предизвика диференцијација поефикасно од условените медиуми во матичните клетки. Сепак, има потреба да се подобрат постојните протоколи за диференцијација. Развиените in vivo модели претставуваат основа за тестирање и споредување на ин витро диференцираните клетки.
11 Вовед 11 1 Вовед 1.1 Преглед на различните типови на матични клетки и нивните својства Матичните клетки се дефинираат врз основа на два критериума (Verfaillie et al., 2002): можност за самообновување и потенцијал да се развијат во различни типови на клетки. Во зависност од онтогенетската старост, се прави разлика помеѓу два вида матични клетки: ембрионални и возрасни матични клетки со различен потенцијал на диференцијација на тоти-, плури-, мулти- или едномоќ (види слика 1). Слика 1 Типови на матични клетки со нивниот потенцијал на диференцијација Една единствена моќна матична клетка има неограничен потенцијал за диференцијација и можност да се развие во целосен организам. Плурипотентни матични клетки
56 ратиони 56 изложија апоптоза. Некои гени се вклучени во клеточната пролиферација, врзување со цитокини, репликација на ДНК, хемотакса и хематопоеза (Додаток). Табела 10 Избрани регулирани профили на изразување на гени на ЦД34 + клетки по 10-дневна култура во стем Спан медиум, во кондициониран медиум Gherardi и во кондициониран саутин медиум во споредба со некултивирани матични клетки. Термин ген без матичен распон-среден услов. Герарди-Средна Конди. Медиум саутин% p Ген без% p Ген без% p GO:
пролиферација на клетки% 5,54E% 1,41E-06 ОДИ:
мононуклеарна %% размножување на клетките ОДИ:
митоза% 1.19E% 3.54E% 8.55E-22 ОДИ:
Репликација на ДНК %% 5.24E + 10 ОДИ:
клеточен циклус% 2.16E% 3.23E% 7.13E-16 ОДИ:
апоптоза% 5,56E% 4,75E% ОДИ:
клеточна диференцијација %% ОДИ:
механорецепција или диференцијација %% ОДЕТЕ:
лизозом% 6,67E% 1,49E% 3,57E + 02 ОДИ:
57 Резултати 57 Матичните клетки култивирани во условениот саутин медиум изразија сличен број на гени како матичните клетки во условениот медиум Герарди, 604 арегулирани гени и 1126 редовно регулирани гени во споредба со некултурните матични клетки. Во најголем дел, гените кои припаѓаат на клеточниот циклус, надворешниот стимул, стимулацијата на хормоните и биосинтезата на стероидите беа регулирани (Додаток). Исто така, имаше акумулација на гени поврзани со микротубуларно-цитоскелетна организација и биогенеза, како што се MID1IP1 и KIF11. Гените од групите, епидермален развој, фокусна адхезија, коагулација на крв и циркулација на крв, исто така, беа изразени на зголемен начин. Во овој медиум, пронајдени се повеќето јата со висок профил на транскрипција за клеточниот циклус, репликација на ДНК и хромозоми и многу малку за апоптоза. Долу-регулирани сигнални патеки беа спој на приврзаници, молекули на адхезија на клетки и сигнални патишта на рецептори на Б-клетки. Понатаму, гените кои припаѓаат на јадрото, врзувањето со факторот на транскрипција, ангиогенезата, врзувањето со МХЦ класа I и производството на хемокин се изразени помалку отколку во некултивираните матични клетки. Изразот на избрани гени на функционалното групирање GO:
58 Резултати 58 Табела 11 Промени во генската експресија на избраните гени од базата на податоци GOTERM_BP_ALL и функционалното групирање: ОДЕТЕ:
61 Резултати 61 рани ендодермални маркери како SOX17 се изразени по краток период на одгледување, а подоцнежните маркери како албумин се изразуваат на ниско ниво во матичните клетки по подолг период на одгледување. Табела 12 Ко-култивирање на матични клетки CD34 + со клетки AML12. Мрна беше изолирана во одредено време и избраните гени беа утврдени со помош на полу-квантитативна РТ-ПЦР (TaqMan). Откриено е дека ко-културата со АМЛ12 клетките ги регулира ЦД34 + клетките во регулирање на генот на експресија на ЦД34 и ендодермалните маркери малку се зголемуваат. Gen 0d 7d 21d CD SOX FOXA AFP CEBPA HNF4A -/+ -/+ н.а. АЛБ -/+ -/+ + КРТ н.а. КРТ н.б. ГАТА4 - - н.а. ЦДХ н.б. GJB1 -/+ ++ н.а. ГЈА н.б. КРТ н.б. Легенда: qrt-pcr: ++++ CT 0,0-4,0; +++ КТ 4.1-8.0; ++ КТ 8.1-12.0; + 12,1-16,0;
Доколку резултатите се зголемат 64, животните биле озрачени со 1,6 Gy од 137 извор на цезиум-γ. Нул глувците NOD/SCID/IL2Rγ исто така ја толерираа оваа доза на зрачење. Тимусните жлезди на имунодефициентни глувци НОД/СЦИД беа многу мали во споредба со имунокомпетентниот глушец НМРИ како контрола. Тие, исто така, не покажаа јасно раздвојување на зоните на срцевина и кортикал и беа хипопластични (Слика 12). Само многу малку лимфоцити беа видливи периваскуларно во ткивото на тимусот кај тест животните со имунодефициенција. Тимусот на NUL/SCID/IL2Rγ глувци наликува на тимусот на NOD/SCID глувци. a b Слика 12 Хистопатолошко испитување на тимусот на имунокомпетентен глувче NMRI (а) и имунодефициентен глушец NOD/SCID (b).
66 резултати 66 а% HLA-I позитивни човечки клетки (нормализирани), 7 3,2 3,1 2,2 1,7 1, мин 30 б 80 А 1 А 2 А 3 А 4 60 А 1,1 А Средна АБ 1 B 2 20 B 3 B 4 Средна B 0% човечки клетки c 20% човечки клетки Коскена срцевина PBS SCF дена по iv апликација PBS SCF слезина дена по iv апликација Слика 13 Климатски расчистување зависно од времето на системски применети CD34 + клетки во глувци NOD/SCID ( а) 4x10 5 CD34 + клетки беа т.в. трансплантирани во озрачени глувци. Нетретирани (цврста, сина линија) или SCF-третирани клетки (испрекината, црвена линија) беа анализирани со FACS во циркулацијата на крвта кај глувците по 1, 5 и 20 минути по апликацијата. Одреден е бројот на човечки HLA-I позитивни клетки од проголтаните клетки. Резултатите се резултат на вкупно три експерименти. Долгорочно пресадување на нетретирани и SCT-лекувани матични клетки во глувци NOD/SCID (b, c). Нетретирани и SCF-лекувани клетки беа i.v. применети и коскената срцевина (б) и слезината (в) анализирани со проточна цитометрија со специфично за човечко антитело HLA-I. Вредностите се средства EM СЕМ од 6-9 глувци по група.
88 A b c 2µm d e Слика 27 Изразување на маркери за плурипотенција на недиференцирани матични клетки SA002. Имуноцитометриско одредување на SSEA-4 (a), TRA-1-60 FITC (b) и Oct-4 (d). Недиференцирани клетки SA002 на ултраструктурно ниво (в). Клетките се карактеризираат со голем сооднос јадро-плазма (јадро темно). Кариограм на матични клетки SA002 p41; Дамка од Гиема (д). Опишаниот кариотип 47, XX + 13 може да се открие за клетките. За да се провери стабилниот кариотип за време на долгорочното одгледување, беа извршени анализи на кариотип на ембрионалната матична клетка линија SA002. Анализата и утврдувањето на кариограмот ги изврши компанијата ИММД Берлин. Линијата на матични клетки беше култивирана со премин 18 и механички претворена 23 пати до првата анализа. SA002-