Инхибиција на изразување на генот ICAM-1 од страна на олигонуклеотиди на троен хеликс - PDF Бесплатно преземање
Од Клиниката и поликлиниката за дерматологија и алергологија на Универзитетот Лудвиг Максимилијанс во Минхен Директор: проф. медицински Д-р х.ц. Г. Плевиг Инхибиција на изразувањето на генот ICAM-1 со олигонуклеотиди на тројна спирала Дисертација за стекнување на докторска диплома по биологија на човекот на Медицинскиот факултет на Универзитетот Лудвиг Максимилијанс во Минхен претставена од Роберт Беш од Минхен 2003
Со одобрение на Медицинскиот факултет на Универзитетот во Минхен. K. Degitz 2. Известувач: проф. Д-р. Беккер Ко-известувач: Надзор од страна на вработен во докторат: Декан: Прив.-Доз. Г. Хартман Проф. Др. Т.Брокер Др. Ц.маршал проф. Д-р. Д-р х.ц. К. Петар Ден на усното испитување: 28 јули 2003 година
Инхибиција на изразувањето на генот ICAM-1 со олигонуклеотиди на тројна спирала
Делови од оваа работа се дел од следната публикација: Бешч, Р., ovanованангели, Ц., Камербауер, Ц., Дегиц, К. Специфична инхибиција на изразот ICAM-1 со посредство на генско таргетирање со олигонуклеотиди кои формираат триплекс Ј.Биол. Chem. 2002; 277: 32473-32479
Содржина ВОВЕД 1. Откривање на структури на тројна спирала. 1 2. Инхибиција на гените со олигонуклеотиди. 2 2.1 Инхибиција на гените со олигонуклеотиди на тројна спирала. 2 2.2 Инхибиција на гените со антисенс олигонуклеотиди. 3 3. Структура на тројната спирала. 4 4. Целни низи за олигонуклеотиди со тројна спирала. 5 5. Олигонуклеотиди со тројна спирала. 6 5.1 Основни аспекти во дизајнот на олигонуклеотиди со тројна спирала. 6 5.1.2 Врзни агли и должини на основните тројки. 7 5.1.3 Својства и стабилност на одделни базни тројки. 8 5.2 Олигонуклеотиди со тројна спирала. 8 5.2.1 Олигонуклеотиди со тројна спирала од типот на пиримидин. 9 5.2.2 Олигонуклеотиди на тројна спирала од типот пурин. 9 6. Модификации на олигонуклеотиди на тројна спирала. 10 6.1 Измени на основите. 10 6.2 Измени на 'рбетот. 10 6.3 Измени на краевите. 11 7. Технологија на тројна спирала. 13 7.1 Биолошка активност на олигонуклеотиди со тројна спирала. 13 7.2 Доказ за формирање на тројна спирала. 14 1 Содржина
8. Молекули на адхезија на клетките. 14 суперсемејство на имуноглобулин. 15 интеграни. 16 селектирани. 16 кадерини. 17 9. Молекулата на клеточна адхезија ICAM-1. 17 9.1 Појава и регулација на ICAM-1. 17 9.2 Имунолошка функција на ICAM-1. 18 9.3 Медицинско значење на инхибицијата на ICAM-1. 19 9.3.1 Воспалителни заболувања на кожата. 20 9.3.2 Други воспалителни болести. 21 9.3.3 Одбрана од отфрлање на трансплантирани органи. 21 9.4 Протеинската структура на ICAM-1. 22 9.5 Генската структура на ICAM-1. 23 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ 1. Материјали. 24 1.1 Хемикалии и растворувачи. 24 1.2 Ензими. 25 1.2.1 Ензими за ограничување. 25 1.2.2 Други ензими. 25 1.3 Антитела. 25 1.4 Плазмиди. 26 1.5 Биолошки материјал. 26 1.5.1 клетки на прокариот. 26 1.5.2 Еукариотни клетки. 26 1.6 Медиуми и медиумски адитиви за одгледување на еукариотски клетки. 26 2 Содржина
1,7 олигонуклеотиди. 27 1.7.1 Тројна спирала и контролни олигонуклеотиди. 27 1.7.2 Олигонуклеотиди кои се користат за производство на целни низи 27 1.7.3 Олигонуклеотиди кои се користат како буквари. 28 1.8 Комплетни комерцијални системи. 29 1.9 Потрошен материјал. 29 1.10 Уреди. 30 1.11 Софтвер. 30 2. Методи. 31 2.1 ДНК техники. 31 2.1.1 Општо ракување со нуклеински киселини. 31 2.1.1.1 Прочистување на ДНК со екстракција на фенол. 31 2.1.1.2 Врнежи од ДНК. 31 2.1.1.3 Гел електрофореза со агарозни гелови. 31 2.1.1.4 Дензитометриска проценка на ДНК опсези. 32 2.1.1.5 Изолација на ДНК фрагменти од гелови од агароза. 32 2.1.1.6 Прочистување на ДНК со силикатни мембрани. 33 2.1.1.7 Одредување на концентрацијата на нуклеински киселини. 33 2.1.2 Подготовка на геномска ДНК од клетките А431. 33 2.1.2.1 Подготовка на геномска ДНК со колони за размена на анјони. 34 2.1.2.2 Подготовка на геномска ДНК со колони на силикатна мембрана. 34 2.1.3 Полимеразна верижна реакција. 35 2.1.4 Означување на нуклеински киселини со дигоксигенин (DIG). 2.1.4.1 Внатрешно обележување на нуклеински киселини. 36 2.1.4.2 Означување на 3 краја на нуклеински киселини. 2.1.5 Пренесување на нуклеински киселини во најлонски мембрани (размачкување). 37 2.1.6 Хибридизација на ДНК со ДИГ-означени сонди (Southern blots). 37 2.1.7 Откривање на нуклеински киселини означени со ДИГ. 37 3 Содржина
2.5 Докази за тројна спирала. 51 2.5.1 Ретардација на гелот. 51 2.5.2 Инхибиција на ограничувачки ензими. 52 2.5.3 Инхибиција на PCR реакција. 52 2.5.4 Откривање на тројни спирали со магнетно одвојување. 53 2.5.4.1 Откривање на тројна спирала на изолирана геномска ДНК. 54 2.5.4.2 Откривање на тројна спирала во клеточните јадра. 55 РЕЗУЛТАТИ 1. Целни секвенци за олигонуклеотиди со троен хеликс во генот ICAM-1. 56 1.1 Идентификација на соодветни целни низи. 56 1.2 Избор на особено соодветни целни низи. 57 2. Дизајн на олигонуклеотиди со тројна спирала. 59 2.1 Олигонуклеотиди со тројна спирала за целната секвенца 13. 59 2.2 Олигонуклеотиди со троен хеликс за целната низа 17. 61 2.3 Дизајн на контролни олигонуклеотиди. 62 3. Студии за приврзаност. 63 3.1 Студии за врзување со олигонуклеотиди со тројна спирала за целната низа 13. 63 3.1.1 Студии за врзување со целни низи на олигонуклеотиди. 63 3.1.2 Студии за врзување на плазмидот. 65 3.1.2.1 Производство на плазмидниот pcm55 со целната секвенца 13. 65 3.1.2.2 Откривање тројна спирала со инхибиција на EcoN I. 66 3.1.3 Сврзувачки студии за препарати на геномска ДНК. 69 3.1.3.1 Инхибиција на ензимот на ограничување Bfa I. 69 3.1.3.2 Откривање на тројна спирала со помош на магнетно одвојување. 70 3.1.4 Врзувачки студии за препарати на клеточно јадро. 72 3.2 Студии за врзување со олигонуклеотиди со троен хеликс за целната низа 17. 76 5 Содржина
3.2.1 Врзувачки студии за низите на целта на олигонуклеотидите. 76 3.2.2 Врзувачки студии за плазмиди. 79 4. Биолошка активност на олигонуклеотиди со тројна спирала. 81 4.1 Инхибиција на изразот ICAM-1. 81 4.1.1 Воспоставување услови за трансфекција на олигонуклеотиди 81 4.1.2 Инхибиција на ICAM-1 од TFO13GT. 82 4.1.3 Инхибиција на ICAM-1 од btfo13cu. 86 4.1.4 Студии за цитотоксични ефекти. 87 4.2 Инхибиција на гените на известувачот. 89 4.2.1 Клонирање на известувачот плазмид. 89 4.2.2 Инхибиција на изразувањето на CAT и влијанието на UVA зрачењето. 92 4.2.3 Дополнителни истражувања за докажување на тројна инхибиција на гени со помош на хеликс. 94 ДИСКУСИЈА 1. Врзувачка способност на олигонуклеотиди со троен спирал. 96 1.1 Студии за олигонуклеотиди кои содржат целни низи. 96 1.2 Студии за плазмиди кои содржат целни низи. 98 1.3 Студии за геномска ДНК. 99 2. Инхибицијата на ICAM-1. 102 3. Активноста на олигонуклеотидите со тројна спирала во системот на модели. 105 4. Влијание на УВА зрачењето врз инхибицијата на гените со олигонуклеотиди на тројна спирала. 106 5. Изгледи. 108 РЕЗИМЕ. 110 СПИСОК ЗА ЛИТЕРАТУРА. 113 ПРИЛОГ. 126 6 Содржина
9.5 Генска структура на ICAM-1 Генот ICAM-1 се состои од 7 егзони, кои се прекинуваат со 6 интрони (Слика 11). Exon Intron Promoter 1 2 3 4 5 6 7 1000bp Сл. 11: Генот ICAM-1. Пропорционална репрезентација на генот ICAM-1, со егзони обележани како нумерирани полиња. Областите во првиот и вториот интрон кои не биле објавени за време на пишувањето се обележани со усеци. Вкупната должина на првиот интрон е околу 4 kb, вториот интрон е подолг од 2,6 kb. Преведената област е прикажана во сиви, непреведени области во бело. Освен неколку помали преклопувања, секој домен на протеинот сличен на имуноглобулин е кодиран од еден од приближно 300 bp долги егзони (Дегиц и сор. 1991). Вонклеточните домени 1-5 одговараат на егзоните 2-6, додека трансмембранскиот и интрацелуларниот дел на протеинот е кодиран со егзон 7 (Ворабергер и сор. 1991). Силната корелација помеѓу геномската организација и поделбата на протеинот во домени е типична за супер семејството на имуноглобулин (Staunton et al. 1988). 23 Вовед
1.2 Ензими 1.2.1 Ензими на ограничување 1.2.2 Други ензими Име алкална фосфатаза од ракчиња Фрагмент на Кленоу од ДНК полимераза I Пво-ДНК-полимераза (лекторирана полимераза) Т4 ДНК лигаза Taq -DNA-полимераза Извор на терминална трансфераза Amersham Pharmacia Biotech (St.Leon-Rot) peqlab (Erlangen) Promega (Heidelberg) peqlab (Erlangen) Roche Diagnostics (Mannheim) 1.3 Ензими за ограничување на антитела се добиени од Roche Diagnostics (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), MBI Fermentas (St.Leon-Rot) ) или добиени од Hybaid-AGS (Хајделберг). Специфичност Специфичност Означување Извор Извор Извор за обележување Човечки ICAM-1 Флуоресцеин изотиоцијанат (FITC) MedSystems Дијагностика (Виена, Австрија) Човечки HLA-DR R-фикоеритрин БД биолошки науки (Хајделберг) (ЈП) глушец IgG1 флуоресцеин изотиоцијан Глушец IgG1 R-фикоеритрин (PE) BD биолошки науки (Хајделберг) 25 Материјал и методи
1.4 Плазмиди Почетните плазмиди за клонирање на известувачките плазмиди беа контрола на pcat ™ -Basic и psv ™-β-галактозидаза (Промега, Хајделберг). ICAM-1 cDNA плазмид (pg4h1), кој се состои од pgem TM -4Z (Промега, Хајделберг), во кој беше клониран фрагмент од 2980 bp фрагмент од ICAM-1 cDNA со употреба на EcoR I и Sal I, дојде од Стаунтон и ал. 1988. 1.5 Биолошки материјал 1.5.1 Прокариотски клетки Ешерихија коли (соединение DH5α) се користеа за репликација на плазмидите. 1.5.2 Еукариотни клетки Сите експерименти беа извршени врз клетки А431 добиени од ATCC (Роквил, Мериленд, САД). 1.6 Медиуми и медиумски адитиви за одгледување на еукариотски клетки Име Име Амфотерицин Б Дулбеко модифициран орел медиум (ДМЕМ) фетален теле серум (FCS) раствор на раствор на хенкс (HBSS) Л-глутамин пеницилин стрептомицин трипсин (0,25%) Технологии (Карлсруе) Технологии за живот (Карлсруе) ccpro (Нојштат/Вајнстрасе) Технологии за живот (Карлсруе) Технологии за живот (Карлсруе) Технологии за живот (Карлсруе) Технологии за живот (Карлсруе) Технологии за живот (Карлсруе) 26 Материјал и методи
2.2 Троен хеликс олигонуклеотиди за целна секвенца 17 За целна секвенца 17, беа развиени антипаралелно врзани тројни хеликс олигонуклеотиди од типот пурин. Тие се состоеле од гванин и аденин (TFO17GA, слика 25 А) или од гванин и тимин (TFO17GT, слика 25 Б). 3'-TEG TFO17GA GGGGGGAAGGGAGGAAG psoralen C6 -5 ', 5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3' 3'-GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG-5 '3'-TEG B TFO17GT GGGGGGTTGGGTGGTTG psoralen C6 -5', 5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3 '3'-GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG- 5 'Сл. 25: Олигонуклеотиди со тројна спирала TFO17GT и TFO17GA. Слика 25 А покажува TFO17GA, кој се врзува анти-паралелно со пуринската низа од целната низа 17, на Слика 25 Б е прикажан TFO17GT, кој исто така врзува анти-паралелно. Двата олигонуклеотиди се врзуваат за двојна спирала со формирање на обратни водородни врски на Хогстин. 5-те краеви беа модифицирани со псорален, 3-те краеви со триетилен гликол. Бидејќи локацијата 5-TpA е на 3-крај од сегментот хомопурин, псораленот беше споен со 5-крај на тројниот олигонуклеотид на хеликс. Основниот гванин во тројниот хеликс олигонуклеотид е додаден на 5-от крај со цел да се донесе псорален во позиција погодна за интеркалација. Бесплатните 3 краја беа модифицирани со триетилен гликол. 61 резултат
2.3 Дизајн на контролни олигонуклеотиди Олигонуклеотиди со мешана низа, кои имаат иста должина и ист основен состав како и соодветните олигонуклеотиди на тројна спирала (измешана контрола), служеа како контроли. Било внимателно да се осигура дека дистрибуцијата на базите е што е можно слична на асоцираните олигонуклеотиди на тројна спирала. За троен хеликс олигонуклеотид btfo13cu, кој може да се поврзе само во паралелна ориентација, олигонуклеотид со превртена низа беше дизајниран како контролна (разменети 3 и 5 краја). Покрај истиот состав, превртените олигонуклеотиди, исто така, имаат иста дистрибуција на бази. Тие беа обележани со inv (за превртена). Исто така, беше осигурено дека модификациите на контролните олигонуклеотиди одговараат на оние на олигонуклеотидите на тројниот хеликс. Аналогно на олигонуклеотидите на тројниот хеликс, се осигури дека контролните олигонуклеотиди не се способни за хибридизација со mRNA на ICAM-1 (антисензутни ефекти). Редоследот на сите контролни олигонуклеотиди со соодветните трокреветни олигонуклеотиди за кои се користени е прикажан во делот за материјали (Дел 1.7.1, страница 27). 62 резултати
Кога TFO17GA беше инкубиран со плазмидот pg4h1 во (без калиум) пуфер инкубација и озрачен, можеше да се забележи инхибиција на реакцијата на PCR од 100-пати поголем моларен вишок на олигонуклеотид на тројна спирала. Понатамошното зголемување на количината на TFO не резултираше со поголема инхибиција. Треба да се напомене дека реакцијата на PCR е спречена само ако обете ДНК насоки биле вкрстено поврзани (бидадукти), бидејќи во случај на монопроводници, спротивната низа од засилувањето на PCR е сè уште достапна. Затоа, комплетната PCR инхибиција на реакционата смеса е малку веројатно. Доколку инкубацијата се одвивала во пуферот што содржел калиум, биле забележани слични резултати, при што може да се забележи инхибиција само од 1.000 пати вишок на TFO. Овој резултат се согласува и со намаленото формирање на тројна спирала во експериментите со ретардација на гелот во присуство на калиум. Реакцијата на ПЦР не беше инхибирана без зрачење. Споредбата на плазмидните опсези покажа дека количината на плазмид што се користи е приближно иста во сите серии и дека разликите во количината на производот на PCR се засноваат на инхибиција на PCR, а не на различна количина на плазмид што се користи. 80 резултати
4.1.3 Инхибиција на ICAM-1 од btfo13cu Откако изразот ICAM-1 беше инхибиран од антипаралелно врзувачкиот троличен хеликс олигонуклеотид TFO13GT, беа спроведени експерименти со паралелното врзување btfo13cu. Овој олигонуклеотид, исто така, имаше инхибиторен ефект врз ICAM-1 (Слика 47). ICAM-1 HLA-DR Нелекуван Е нелекуван B IFNγ F IFNγ C btfo13cu G btfo13cu D bcoinvcu H bcoinvcu Сл. 47: HLA-DR израз и ICAM-1 израз на A431 клетки по трансфекција со btfo13cu. Лево е прикажано боењето со анти-ICAM-1 антитело означено со FITC, од десната страна боењето со PE-конјугирано анти-HLA-DR антитело. Клетките биле или нетретирани (Слика 47 А и Е), третирани со IFNγ (Слика 47 Б и Ф) или трансфектирани пред третманот со IFNγ со 2 μm btfo13cu (Слика 47 C и G) или 2 μm bcoinvcu (Слика 47 Д и Н) биле 86 резултати