Ин-витро анализа

За многу студии кои не се можни на испитаниците, ин-витро-тест процедурите стануваат сè поважни.

За козметички производи кои често се користат подолг временски период, дерматолошкото тестирање за безбедност е основен предуслов за високо ниво на безбедност на апликацијата и задоволство на клиентот. Со утврдување и проценка на сигурни и репродуктивни биолошки крајни точки врз основа на хистолошки и биохемиски анализи, може да се даде изјава за ефектите на производот врз регенеративните биолошки процеси на кожата.

3Д-моделот на кожата е особено погоден за такво испитување, бидејќи ја формира природната хистолошка низа на слоеви на епидермални клетки и кожни структури, како што е познато од епидермисот на човекот. Стратумот базал, основниот кератиноцитен слој, лежи директно на жив еквивалент на дермисот (фибробласти) и е хистолошки проследен со слојот на слојот и гранулозумот на слојот, кои конечно се покриени со роговидни клеточни слоеви на роговиден слој.
Нарушувања на редовната епидермална корнификација (ортокератоза), предизвикани од разни стимули од физичка (механичка, УВ-А/Б) или хемиска (СЛС) природа, може да се анализираат и проценуваат квантитативно и квалитативно.

Во ин-витро студиите истражуваме:

Интегритет на кожата бариера/регенерација по оштетување,
УВА/Б штета,
Компатибилност на производот.

епидермална диференцијација,
Кожа бариера на релевантни структури,
виталност,
Интегритет на дермо-епидермалната зона (DEJ),

Морфолошко-хистолошки структури по специјално боење,
Боење со имунофлуоресценција на протеини вклучени во диференцијацијата на корнеоцитите,
Квантификација на интерлеукини (на пр. IL-1α, Il-6) со користење на ензимски имуноабсорбента анализа (ЕЛИСА),
други методи во развојот.

Хистолошка анализа

Хистологијата е наука за биолошките ткива (хистос = ткиво & логоа = настава). Со помош на хистологија, ткиво-морфолошките промени на клеточно ниво може да се направат видливи преку специфично боење и соодветно да се проценат. Најчестото боење што се користи во хистологијата и хистопатологијата е боење со H&E. Тука, нуклеинските киселини се обоени интензивно темно сина, цитоплазмата и сврзното ткиво розово-црвена. На сликата подолу е прикажано боење со H&E на здрав модел (A) и UVB-изложен, оштетен модел (B).

Боење со хематоксилин и еозин (У & Е) на ултра тенок пресек А) нетретиран модел Б) УВБ-озрачен модел (250 mJ/cm2) по 48 часа. затворени стрели: согорувани ќелии; отворени стрели хидропни клетки (масивна акумулација на течност). *: типична дискератоза (нарушување на корнификацијата) по изложеност на УВ зраци.

Моделот ги прикажува сите физиолошки слоеви (базалеј на слојот, спинозумот, гранулозумот и рожницата) на природната човечка кожа, како и вистинската корнификација (А). Слика Б покажува модел 48 часа по изложеност на УВБ (250 mJ/cm2).
Типичните карактеристики на изгореници од сонце се јасно препознатливи. Бројни таканаречени „изгорени сончеви клетки“ (затворена стрела), хидропни клетки, кои содржат повеќе течност и помалку силно обоено јадро (отворени стрели), како и типично нарушување на корнификацијата (дискератоза).
Покрај тоа, може да се видат изолирани вакуолизирани кератиноцити. Користејќи го овој модел, заштитната функција (заштита од сонце) и/или регенеративниот потенцијал на формулацијата или одделни супстанции може да се испита и процени на клеточно ниво.

Анализа на стапката на клеточна делба

Стапката на клеточна поделба (пролиферација) е важен показател за виталноста или „подготвеноста“ на ткивото. Во епидермисот кај човекот, само кератиноцитите на страната на базалето (базални кератиноцити) се способни за поделба на клетките. Овие ги компензираат загубите на корнеоцитите поради трајниот процес на ексфолијација, со што се обезбедува хомеостаза на ткивото и се спречува клеточно истенчување на епидермисот.

Ултра тенок дел од целосен модел на кожа. А) слика на светло поле Б) слика на флуоресценција. Сина = клеточни јадра, црвена: клетки што делат.

Користејќи ја технологијата Click-It EdU®, базалните кератиноцити на епидермисот и фибробластите на дермисот можат да бидат означени (A + B) во моделот на кожата за време на клеточната делба (митоза). Врз основа на ова може да се утврди дали супстанција или формулација влијае на однесувањето на клеточната делба по дефинирана локална или системска апликација и време на третман.
Спроведување на нетретирана контрола овозможува да се измери процентот на стапката на клеточна поделба. Примери за зголемена активност на клеточната делба: заздравување на раните, воспалителни процеси.

Интегритет на кожата бариера

Друг важен параметар за здрава кожа е недопрена кожна бариера, која од една страна спречува прекумерно губење на вода, а од друга страна претставува ефикасен заштитен штит од патогени, влијанија на животната средина и (хемиски) штетни материи.

Ултра тенок дел од целосен модел на кожа. А) Третман со стерилен PBS Б) 45-минутен третман со 1% SDS.
Сино = клеточно јадро, зелено: Боење со жолто жолто.

Индивидуални супстанции, целосни формулации или хемиски нокса можат да влијаат на интегритетот на бариерата на кожата. Ова може да доведе до зголемена загуба на вода (зголемено испарување) и апсорпција на штетни агенси од околината, кои (пасивно) влегуваат во кожата. Во моделот со целосна кожа, прикажаната жолта боја на Луцифер може да се искористи за да се испита дали некој производ влијае на бариерата на кожата. Стерилната вода или PBS (солен раствор на фосфат) немаат никакво влијание врз интегритетот на бариерата (А). Локално нанесената боја останува целосно во горните слоеви на кожата (роговиден слој).
45-минутен третман со сурфактант СДС (1%), сепак, доведува до оштетување на бариерата на кожата (Б). Бојата продира во подлабоките слоеви на кожата (дермисот). Овој метод може да се користи и за да се испита дали некој производ може да ја врати функцијата на бариерата по оштетувањето.