Матрикс металопротеинази и нивни инхибитори во текот на експерименталниот хроничен

1 Матрикс металопротеинази и нивни инхибитори во текот на експерименталниот хроничен панкреатит.

металопротеинази

2 Матрикс металопротеинази и нивни инхибитори во текот на експерименталниот хроничен панкреатит. урна: nbn: de: gbv: 28-дис

4 1 Вовед и испитување Вовед Екстракција на материјал Панкреатични заболувања Акутен панкреатит Хроничен панкреатит imalивотински модели на панкреатит Модели на акутен панкреатит Церулеин панкреатит Исхрана со малку холин Моделот трипсин Оперативна опструкција на дуоденумот Модели на хроничен панкреатит Оперативна опструкција на дуоденумот олеинска киселина линеарна киселина од трансформирање на факторот на раст - во панкреасот во прекумерна експресија на глувчето на трансгенирање на фактор на раст - во панкреас во трансгенски глушец Трансгенско глувче со доминантно-негативен мутант на рецепторот ТГФ тип II панкреасна супа од храната, предизвикан од тринитробензен сулфонична киселина (TNBS) Хроничен експериментален панкреатит предизвикан од Дибутилин дихлорид Панкреасните elвездени клетки матрикс металопротеинази и ткивни инхибитори на матрикс металопротеинази фиброза, клетки на панкреатични elвезди и матрични металопротеинази 16 2 Материјал и методи Материјал Хемикалии ДНК Олигонуклеотиди Бафери и раствори Бактериски култури Медиумски комплети Лабораториски животни Апарати за потрошен материјал Индукција на хроничен ДБТЦ панкреатит 21 1

5 2.3 Екстракција на РНК од панкреасот Откривање на контролниот фрагмент за изразување на мрна Плазмидно ДНК засилување на бактериите Квантификација на нуклеински киселини РНК електрофореза Обратна транскриптаза Конкурентна полимераза Реакција на синџирот Електрофореза на ПЦР производи и флуоресцентна анализа и гел за редење Извршување на електрофореза и проценка на боење со хематоксилин и еозин 32 3 Резултати Хистологија на ДБТЦ панкреатит Прилагодување на ЦДНА со помош на -актин израз на матрични металопротеинази во експресија на ткиво на ММП експресија на ММП-2 и ММП експресија на ткивен инхибитор на матрична металопротеиназа во ткиво Изразување на TIMP Изразување на TIMP MMP во клетките на reatвездената жлезда на панкреасот Статистика 41 4 Дискусија Текот на ДБТЦ панкреатит ММП ММП-9 од леукоцити Однос помеѓу базалната мембрана и ММП синтезата на ММП-9 во изразите на ПСЦ РНК на ММП-9 кај хроничен ДБТЦ панкреатит РНК експресија на ММП-2, ММП-3, ТИМП-1 и ТИМП-2 кај хроничен ДБТЦ панкреатит Заклучоци 47 2

6 5 тези 48 6 список со кратенки 51 7 литература 52 8 признание 66 9 декларација за независност 67 3

16 Слика 1: Клетките функционираат под влијание на протеолитички активни ММП. (А) Деградација на ECM и миграција на клетки. (Б) индукција на пролиферација или апоптоза. (В) Модулација на медијатори и нивни рецептори. (Г) Активирање на понатамошни протеази со расцепување на нивните проензими или нивниот инхибитор (Ву и Верб, 2000). 3 Матрикс металопротеиназите се група од над 20 познати цинк-зависни протеази. Овие се во состојба да ги разградат основните компоненти на вонклеточната матрица, како што се колаген, ламинин, фибронектин или еластин. Поради нивната структура од различни домени, ММП може да се поделат во четири групи: матрилизин, ММП со домени слични на хемопексин, ММП со трансмембрански домени, ММП со домени слични на фибронектин. Сите ММП имаат регион потребен за лачење, се во латентна состојба и имаат каталитички регион кој содржи активно место за врзување на цинк. 53 Сепак, класификацијата на ММП се заснова на поделба на семејства што ги сумираат подлогите на ММП (Таб. 1)

18 Ова важи и за про-ензимите. Преклопувањето на специфичноста се објаснува со 50% низа хомологија на TIMP-1 и TIMP-2. 58,61 Како резултат на активноста на ММП зависи од односот на ММП и ТИМП во ткивото. Промените во оваа рамнотежа водат или до значително зголемена протеолитичка активност на ММП 59 или до зголемена фиброгенеза. 60 Име TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 Функција Инхибира Pro-MMP-9 и други активни MMPs Инхибира Pro-MMP-2 и активен MMP-2 Не е дефинирано Не е дефинирано Табела 2: Инхибитори на ткиво на металопротеинази на матрица ( TIMP) и нивните функции Слика 2: Каскада на активирање на матрикс металопротеиназите од страна на катепсин и плазмин. Автоматско активирање на Pro MMP со активни MMP и MT MMP 1. Инхибиција на деградацијата на матрицата од страна на TIMP. (Еванс и сор. 1999) 61 15

22 TIMP 2 должина на ампликон: 453 bp TIMP 2 антисенс CAA CAG GCG TTT TGC AAT GCA GA должина: 23 bp CCC ATT GAT GCT CTT CTC TGT GA должина 23 бп вектори pqr2 и pqr3 од Graham M.A. Wells, Neures Limited, Велика Британија Бафери и раствори Комаси Блу раствор DBTC раствор DEPC- H 2 O 1 дел глацијална оцетна киселина (50 ml) 3 делови изопропанол (150 ml) 6 делови H2O (300 ml) Додадете 0,25 g Comassie Blue на 100 ml (1,25 g) . Растворете го DBTC со 96% етанол во два дела. Потоа се меша со три дела глицерол. Инкубирајте 1 L dh 2 O со 1% DEPC преку ноќ. Потоа деактивирајте го DEPC со автоклавирање. Еозин 2,5 g еозин (индекс на боја бр) 500 ml H 2 O HBSS + FCS Mayers Hematoxylin PBS (фосфат пуфер солен раствор) полиакриламид електрофореза пуфер 50 ml HBSS и 15 ml FCS 4%, ставете го на мраз. Следното се раствора во 750 ml вода: 50g алуминиум сулфат (KAl (SO 4) 2 12H 2 O) 1g хематоксилин (индекс на боја бр) 0,1 g натриум јодит (NaIO 3) 1,0g лимонска киселина 50g хлорохидрат Ad H 2 O до 1000ml 120mM NaCl 170 mm NaH 2 PO 4 3 mm KCl 26 mm KH 2 PO 4, ph 7,2 3,03 g (0,025 M) Трис 14,1 g (0,152M) глицин 1,0 g (0,1%) SDS до 1000 ml исполнет со H 2 O. Тампон P1, Qiagen 50mM Tris ph mM EDTA Rnase A (400μg/ml) Тампон P2, Qiagen 200mM NaOH 1% SDS Буфер P3, Qiagen 2,55M KAc ph 4,8 тампон QBT, Qiagen 750mM NaCl 50mM МОПС 15% етанол ph

23 Buffer QC, Qiagen Buffer QF, Qiagen Stop Solution Substrate Buffer TAE Buffer 1L 1M NaCl 50mM MOPS 15% Ethanol Ph M NaCl 50mM MOPS 15% Ethanol ph mg Orange G 2.5g Ficoll 400 EDTA 0.5M 50mmol/l Tris ph8 + 5mmol/l CaCl2 242 g Tris 57 ml оцетна киселина 96% 100 ml EDTA 0,5M ph8 до 1000 ml H 2 O дистрибуиран. Триз пуфер Tris-HCl 1 M во DEPC-H 2 O, pH 7,4 раствор на тритон 2,5% 10 ml тритон + 490 ml H 2 O медиум на бактериска култура Ешерихија коли соединение DH5 од Gibco BRL (Еггенштајн, Германија) се користеше како бактериски вид. Културни медиуми за раст на бактериите се добиени од Difco Laboratories, Детроит, САД. Ампицилин LB агар плочи Додадете 100 mg/l ампицилин во агарните плочи LB. ЛБ агарски плочи Лурија Бертани (ЛБ) - екстракт од 5g квасец од средна големина 10g триптичен пептон 10g NaCl аква дест. 15g агар H 2 O преобразувајте на 1l 5g екстракт од квасец 10g триптичен пептон 10g NaCl аква дест. Прилагодете се на pH 7,4 H 2 O повторно. Со 1 N NaOH. до 1 l тампон за трансформација 10% (wt/вол) полиетилен гликол mM MgCl 2 во LB-средни комплети Qiagen Miniprep Qiagen Maxiprep QIAquick Spin RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Германија Qiagen, Hilden, Германија Qiagen, Hilden, Германија Qiagen, Hilden, Германија 20-ти