Означување протеини Како да изберете ознака за вашиот протеин

Сара Клинк

Датум на објавување: 7/2019; tpub_215

Апстракт

Означувањето протеини е важен аспект на анализата на протеините. Да се биде во можност да ги обележите вашите протеини за разни апликации, вклучувајќи прочистување, анализи за повлекување, имуно-анализи и повеќе може да ви помогне да ја дефинирате функцијата на протеините. Но, која ознака треба да изберете? Оваа статија опфаќа неколку опции за афинитет или ознаки базирани на репортери и реагенси кои можат да ви помогнат во експериментите.

Вовед

Протеините или полипептидите се составен дел на клеточната функција. Тие се ензими кои сочинуваат патеки за енергетски метаболизам, клеточен раст, сигнализација, митотичен циклус и клеточна смрт. Способноста да се изолираат и детектираат специфични протеини ни овозможува да разбереме кои протеини се дел од поголемите комплекси, кои протеини комуницираат и нивната улога во клеточната функција и средствата на болеста. Еден начин да се испита функцијата на протеинот е со додавање ознака на протеинот од интерес и негово одделување од клеточен лизат за проучување на протеинот.

Фузионите ознаки можат да бидат полипептиди, мали протеини или ензими додадени на амино (N) или карбокси (C) крај на протеин. Означувањето може да се изврши преку клонирање во вектори или да се додаде со помош на уредување на генот CRISPR-Cas9 за означување на ендоген протеин. Користејќи ознака за афинитет, можете да изолирате или имобилизирате протеин за дополнителни протеомски студии.

Додека истражувачите најчесто означуваат протеин за да го прочистат од клеточен лизат и го користат изолираниот протеин во биохемиски анализи, пептид-ознаката може да направи повеќе. На пример, протеините означени со епитоп може да се детектираат со специфично антитело ако нема антитела специфични за вашиот протеин. Покрај тоа, ознаките исто така можат да ги квантитираат протеините, да учат протеински комплекси и да утврдат дали протеинот е внатре или надвор од клетката. Можете дури и да ја визуелизирате локацијата на протеините во ќелијата поради ознаката на вашиот протеин.

Па, која ознака на протеини е соодветна за вашите експерименти? Подолу е список на опции за означување на протеините со алатки што можат да помогнат.

Полихистидини

Една од наједноставните и најмалите ознаки е ознаката полихистидин или ознаката 6XHis. Типично, оваа ознака на пептид е составена од шест хистидин аминокиселини кои можат да бидат поставени на терминалот на N или C на протеин. Поради својата мала големина, ознаката His има тенденција да не ја менува структурата на протеинот, што е корисно за тестовите по течението. Покрај тоа, ознаката His може да се поврзе со метални јони како Ni 2+, Zn 2+ и Cu 2+, што го прави корисен за прочистување или имобилизација на фузиони протеини.

Полихистидинската ознака работи добро за брзо прочистување на протеините изразени во E. coli, но за протеините изразени во клетки на цицачи или инсекти, поголемиот број на остатоци од хистидин значи дека има поголемо врзување во позадина. Затоа, за да се зголеми чистотата на протеините, металните смоли кои ги врзуваат протеините означени со Него, треба строго да се измијат. Покрај тоа, агентите за денатурирање како 8М уреа или 6М гванидин HCl може да се користат со мембрана означена со Него или нерастворливи протеини за да се подобри прочистувањето.

За да ја додадете ознаката His на вашиот протеин, клонирајте го ORF во вектор што ја носи ознаката. Во зависност од користениот промотор, изразете го обележаниот протеин во клетките на бактериите, цицачите или инсектите. Алтернативно, можете да користите системи за изразување без клетки за изразување на протеини. За прочистување на протеинот, можете да користите магнетни зрнца (на пример, MagneHis System Систем за прочистување на протеини) или немагнетни смоли (на пример, HisLink System Систем за прочистување на протеини) за клеточни лизати. Доколку вашиот протеин означен со Него е изразен во систем базиран на зајак-ретикулоцитен лизат, системот за прочистување на протеини MagZ is е корисен за прочистување на протеини со минимален хемоглобин. Откако ќе се измие од матрицата за прочистување, вашиот обележан протеин е подготвен да се користи за понатамошна истрага.

Прочистување на протеини означени со полихистидин

Глутатион-С-трансфераза

Глутатион-С-Трансфераза (GST) е афинитетна ознака што се користи за протеините изразени во E. coli за прочистување на обележаните протеини од бактериски лизати. Оваа ознака на пептид од 26kDa е дел од семејство цистолни протеини присутни во еукариотите, што го прави помалку корисен при обид да се изолираат протеините од еукариотските клетки поради конкуренцијата со другите протеини. Означувањето на еукариотските протеини со GST ја подобрува растворливоста на фузини протеините кога се изразува во бактерии. Покрај тоа, протеините означени со GST можат да се изразат на високо ниво во бактериите, но може да формираат тела за вклучување поради агрегација на протеини. Ознаката GST може да се додаде во N или C терминалот на протеинот од интерес.

GST има силен афинитет кон глутатион, што значи дека можете да фатите точки на протеини GST на имобилизирана матрица како мониста обложена со глутатион. Оваа карактеристика на врзување се користи за прочистување на протеини, како и за фаќање протеини кои можат да се врзат за вашиот протеин (на пример, анализи за повлекување).

Додека протеините со ознака GST можат да бидат многу изразени и повеќе растворливи, големата големина на ознаката може да пречи на функцијата на протеините во низводните апликации. Можеби ќе можете да го раздвоите вашиот протеин од ознаката GST, намалувајќи ги можните функционални пречки. Ако изразениот протеин се собрал во инклузивно тело, прочистувањето на афинитет со употреба на глутатион станува проблематично. Треба правилно да се преклопи GST за успешно врзување со глутатион и дури и ако ознаката GST се преклопи, вашиот протеин од интерес можеби не е.

За да ја користите ознаката GST, започнете со клонирање на кодирачката област за протеинот од интерес во вектор и изразете го обележаниот протеин во Е коли. Користењето индуктивен промотор за контрола на изразувањето на целните протеини може да помогне во протеините токсични за клетките на бактериите. Штом ќе се лизираат бактериските клетки (на пример, со користење на реагенс FastBreak ™ Cell Lysis Reagent), можете да го прочистите протеинот означен со GST со помош на смола базирана на глутатион (на пример, MagneGST ™ Систем за прочистување на протеини). Во зависност од користениот вектор за клонирање, може да има место на расцепување на протеаза за отстранување на ознаката GST од вашиот протеин. Откако вашиот протеин е елуиран или расцепен, тој е подготвен за анализа.

Прочистување на фузии на ГСТ-протеини

HaloTag® протеин

Додека ознаките GST и 6XHis се корисни за изолирање на протеините изразени во бактериските клетки, постојат опции за обележување кои се компатибилни и со E. coli и со клетките на цицачите. Протеинот 34kDa HaloTag® ја нуди оваа флексибилност на системот за изразување. За разлика од другите ознаки кои користат нековалентни интеракции за прочистување на протеините, основата на технологијата HaloTag® е ковалентното врзување помеѓу HaloTag® протеинот и неговиот лиганд. Поради јачината на ковалентната врска, можете да го измиете обележаниот протеин под строги услови и во основа да ја елиминирате секоја неспецифична протеинска позадина. Загрижени сте за големината на ознаката што влијае на функцијата на вашиот протеин? Нема проблем! Само користете TEV протеаза за да го раздвоите вашиот протеин од HaloTag и прочистениот, неозначен протеин е подготвен да се користи во низводно анализирање.

Еден од предизвиците на изразување на протеини во бактериските клетки е растворливоста. Еукаројтните протеини не се метилирани и немаат други пост-преведувачки модификации кога се синтетизираат во E. coli, што ги прави склони кон формирање тела за вклучување. Фузионите ознаки, како оној на HaloTag® протеинот, можат да ги направат рекомбинантните протеини повеќе растворливи, па дури и да го подобрат изразувањето во бактериите, што го прави вашиот протеин од интерес полесен за прочистување. Со изразување на вашата HaloTag-протеинска фузија во клетките на цицачите, ќе бидат присутни пост-преведувачки модификации, поблиску одразувајќи како протеинот ќе функционира под клеточни услови. Користејќи имобилизирана матрица како смола обложена со HaloTag® лиганд, можете да прочистите само протеини со HaloTag присутни или да користите во повлечни анализи за да откриете кои протеини или протеини се врзуваат за вашиот протеин од интерес. На овој начин, можете подобро да ги разберете интеракциите на протеините.

Но, апликациите не запираат со протеини: интеракции на протеините и прочистување на протеините. Ако сакате да истражите каква секвенца на ДНК врзува вашиот протеин, технологијата HaloTag® може да помогне во дешифрирање на протеинот: интеракција на ДНК. Што да се користи имунохемија? Имаме антитела за тоа. Заинтересирани сте за слики на клетки? Со вашиот протеин споен со HaloTag® протеин и флуоресцентни HaloTag® лиганди, можете да откриете каде е локализиран вашиот протеин, дали е распрскуван и колку брзо се превртува. Постојат дури и лиганди за микроскопија со супер резолуција и FACS. Дознајте повеќе за технологијата HaloTag® тука.

За да започнете со технологијата HaloTag®, клонирајте го кодирачкиот регион за вашиот протеин од интерес во традиционалните или Flexi® клонирачките вектори за да додадете HaloTag на терминалот N или C. Алтернативно, можете да пребарувате за кој било од илјадниците претходно изградени HaloTag® клонови достапни од Казуза. Откако ќе го имате клонот, можете да го користите за секоја апликација за анализа на протеини. Во зависност од тоа што сакате да направите следно, можеби ќе ви треба систем за прочистување (на пример, HaloTag® Систем за прочистување на протеини кај цицачи или HaloTag® Систем за прочистување на протеини) или анализа за повлекување (на пример, HaloTag® Mammalian Pull-Down системи). За студии за сликање, ќе треба да го одберете вистинскиот флуоресцентен лиганд (на пример, HaloTag® лиганди или Janelia Fluor® HaloTag® лиганди). Доколку сте заинтересирани за имунолошки студии, Anti-HaloTag® pAb ќе ви помогне. За интеракции на протеините, постојат NanoBRET ™ PPI системи за протеини: студии за интеракција на протеини и HaloCHIP ™ систем за испитување на протеини: ДНК интеракции.

HaloTag® технологија за заменливо обележување

Слика 1. Оваа илустрација покажува како HaloTag® протеинот е споен во протеин од интерес и ковалентното врзување помеѓу HaloTag и неговиот лиганд.

Додека повеќето од пептидните ознаки дискутирани претходно се афинитетни ознаки за употреба во прочистување на протеини, повлечни анализи или методи што го врзуваат обележаниот протеин со цврста матрица, постојат и други видови ознаки за различни апликации. Од квантитациони протеини до ендогени обележувања, биолуминисцентна ознака или дури и мал известувачки протеин споен во протеин може да се користи за следење на обележан протеин во клетката, елиминирање на потребата од антитела.

HiBiT

Помалиот е подобар за многу работи и малата 11-аминокиселинска пептидна ознака наречена HiBiT е одлична за обележување на протеин. Ако сакате да го прескокнете традиционалното клонирање, можете дури и да користите уредување на гени CRISPR за да ја додадете ознаката HiBiT на ендоген протеин. Ова има предност да проучува протеин без преголема експресија што обично се гледа кога се користи егзоген израз од плазмид. Со одржување на клеточните протеини во исти пропорции што се наоѓаат во клетката, вие сте во можност да ги проучите промените во обележаниот протеин под физиолошки услови. Оваа предност значи помалку артефакти од прекумерна експресија на протеини и повеќе биолошки релевантни резултати. Протоколот CRISPR за додавање на пептидната ознака е едноставен и е мал, ако HiBiT нуди висока ефикасност на уредувањето.

Самостојно, HiBiT не е биолуминисцентен. Меѓутоа, штом се додаде реагенс за откривање кој содржи комплементарен LgBiT протеин, се произведува светла луминисцентна сигнализација. Квантитативниот сигнал е лесен за мерење со користење на луминометар. Биолуминисцентните анализи се чувствителни и нудат откривање до наномоларни нивоа. Сакате да испитате екстрацелуларни или лачени протеини? Имаме систем на реагенси за тоа! Комбинирајте го квантитативирањето на вкупниот обележан протеин со нашиот литички систем и испитајте ги нивоата на лачениот протеин користејќи го нашиот вонцелуларен систем.Дури можете да ја елиминирате потребата од антитело и да го користите нашиот биолуминисцентен систем на размачкување за да откриете протеини размачкани во мембраната. Ако LgBiT се изрази интрацелуларно, можете кинетички да откриете изобилство на протеини означени со HiBiT во живите клетки. Погледнете како можете да користите HiBiT за означување протеини тука.

За да започнете да користите HiBiT, можете да го клонирате вашиот ORF во некој од нашите традиционални вектори MCS или Flexi® или да користите метод CRISPR за да ја додадете ознаката во геномската низа. Ставете ја ознаката каде што е потребно за оптимално откривање. Откако вашиот протеин е обележан со HiBiT, утврдете кој метод најдобро одговара за вашите студии (Nano-Glo® HiBiT Lytic, Intracellular или Blotting Systems).

Преглед на системот за откривање на литичко откривање на нано-Glo® HiBiT

НаноЛучи Лусифераза

Понекогаш само известувач ќе стори. За среќа, NanoLuc® луциферазата е ензим од 19kDa, што го прави биолуминисцентниот протеин доволно мал за да се прошета со друг протеин без да се меша со нормалните клеточни функции. Слично на HiBiT, NanoLuc обезбедува чувствителна, лесно квантифицирана ознака на протеинска фузија. Сепак, ензимот известувач не бара партнер за комплементација, поедноставувајќи ја неговата употреба во некои апликации. Осветленоста и малата големина значат дека NanoLuc® луциферазата може да се вклопи во вирусни честички без да предизвика потешкотии. Прочитајте како тоа го направија овие истражувачи на вирусологија. Како репортерски ензим, NanoLuc® луциферазата може да помогне во откривање на клеточна локација на фузиен протеин, како и следење на патот по кој може да се движите вашиот протеин. Покрај тоа, фузионите протеини NanoLuc® може да се користат во апликации засновани на биоломинисценцијална резонанца на енергија (БРЕТ) за проучување на протеини: интеракции на протеини или таргетирање на малите молекули. Дознајте повеќе за можностите на овој ензим репортер.

За да создадете фузија на протеини со NanoLuc® луцифераза, треба да го клонирате вашиот ORF во вектор на NanoLuc® репортер, ставајќи го NanoLuc на терминалот N или C. Во зависност од вашата апликација, можете да користите систем за откривање литик (на пример, систем за анализа на нано-Глош луцифераза) или анализа за откривање на живи клетки (на пример, систем за анализа на живи клетки на нано-гло G).

Резиме

Изборот на ознака за вашиот протеин се заснова на вашите експериментални потреби. Без разлика дали ви треба афинитетна ознака за прочистување на протеините, сакате да создадете единствен фузионен протеин што ќе се користи во различни методи на анализа на протеини или да додадете ендогена ознака со употреба на уредување на генот CRISPR-Cas9, има низа ознаки и ензими на репортери на располагање.