Подготовка на примероци на ларвоза Дрозофила за гасна хроматографија-масена спектрометрија (GC-MS) базирана

Резиме

Овој протокол опишува како да се подготват ларвите Дрософила за метаболомска анализа базирана на ГЦ-МС.

Апстракт

Вовед

Овошната мушичка Дрософила меланогастер се појави како идеален систем за проучување на молекуларниот механизам што го регулира средниот метаболизам. Не само што се зачувани повеќето метаболички патишта помеѓу луѓето и Дрозофила, туку важните сензори на хранливи материи и регулаторите за раст, како што се инсулин, Tor и Myc, исто така се активни во лет 1, 2. Ова и овозможува на Дрософила да ја истражува метаболичката основа на човечки болести, дијабетес и дебелина до невродегенерација и рак. Во овој контекст, развојот на ларвата Дрософила обезбедува идеално опкружување за метаболички степен познат како аеробна гликолиза или ефект на Варбург. Исто како што многу тумори создаваат биомаса на аеробна гликолиза од јаглени хидрати, така сторете го и тоа со активирање на аеробната гликолизата на ларвите Дрософила за да се промовира раст на развојот 3, 4, 5 Овие сличности помеѓу метаболизмот на ларвата и туморот за да се воспостави Drosophila како модел за разбирање како аеробната гликолиза е регулирана in vivo.

И покрај фактот дека мувата се појави како популарен модел за метаболизам, повеќето студии за Дрософила се потпираат на методи дизајнирани за мерење на индивидуалните метаболити 3, како што се трехалоза, триглицериди или АТП. Бидејќи е потребен специфичен протокол за мерење на секој метаболит, студиите базирани на анализа се интензивни, скапи и пристрасни кон овие соединенија, што може да се мери со комерцијални комплети. Решение за овие ограничувања произлезе од областа на метаболомиката, што обезбедува поефикасно и непристрасно средство за метаболизмот на Дрозофила. За разлика од студија заснована на анализа, единствена метаболомска анализа може истовремено да измери стотици метаболити од мала молекула и да обезбеди сеопфатно разбирање на метаболичкиот статус на организмот 6, 7. Оваа техника значително ги прошири студиите за метаболизам во Дрософила и ја претставува иднината на ова поле што се појавува 8 .

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

2. Собирање примерок од ларви

    Возрасни ларви до посакуваната фаза. Кога ларвите L3 се соберат, ресинхронизирајте ги примероците при топење на L2-L3. Ресинхронизацијата често се постигнува преку претходно опишан метод кој ги користи предните дупки за дишење како развојно нарушување како пресвртница 15. Алтернативно, ларвите од средината на L3 може да се синхронизираат со SGS3 репортер ген 16.
    Белешка: Во овој контекст наоѓаме ларви средни L2 (

30 сек. За време на ова време, ларвите ќе потонат на дното на цевката, но квасецот ќе остане во суспензија. Откако сите ларви формираат лабава топче, отстранете го растворот на NaCl со пипета од 1 ml.

  • Повторете 2,4 и 2,5 чекори двапати или додека не се расчисти последниот раствор за миење.
    Забелешка: Може да бидат потребни дополнителни чекори за перење ако собраниот примерок содржи прекумерна количина квасец.
  • Центрифугирајте ги примероците на 2000 × g за 1 мин на 4 ° C.
  • Извадете го преостанатиот раствор со пипета од 200 μL.
  • Веднаш замрзнете го примерокот во течен азот.
    Белешка: Протоколот може да се паузира во оваа точка. Примероците може да се чуваат на -80 ° C до 3 месеци

    • 3. Пренесете ги примероците во цевки со монистра

    16 часа да се заврши).
    Белешка: Доколку е потребно, протоколот може да се паузира во овој момент. Исушениот примерок може да се чува на -80 ° C

    (5) хемиска дериватизација

    Забелешка: Во повеќето случаи, корисникот ќе го изврши овој чекор со помош на јадрото на масената спектроскопија. Овој протокол е наменет да се користи со колони GC од 30 m, со колона за заштита 5 m.

    1. Случај нарачајте го примерокот.
    2. Подгответе GC-MS.
      1. Поставете ја брзината на проток на гас носач на хелиум на 1 mL/min.
      2. Поставете ја температурата на проток на 250 ° C.
      3. Програмирајте го GC за извршување на следниов градиент на температура:
        1. Почетна температура 95 ° C со влијание од 1 мин.
        2. Зголемете ја температурата на 110 ° C со стапка од 40 ° C/мин за задржување од 2 мин.
        3. Зголемете ја рампата на 250 ° C до 5 ° C/мин.
        4. Зголемете го крајното запирање од 4 мин со брзина од 25 ° C/мин на 330 ° C.
      4. Поставете го доцнењето на растворувачот на 3,5 минути
        Белешка: Времето може да се смени во согласност со системот GC-MS. Овој чекор е наменет да спречи MSTFA и MOX да го оштетат детекторот.
    3. Инјектирајте 1 μL дериватизиран примерок во GC-MS (разделен раздел од 10: 1).
      Забелешка: Инјектирајте 2 μL од примерокот ако интензитетот на врвовите е премал. Редоследот на инјектирање на примероците треба да биде рандомизиран.
    4. Ракувајте со масенскиот спектрометар во режим на целосно скенирање, во опсег на маси од 50 - 500 m/z.

    1. Метаболомската анализа на податоци користи или насочен или ненамерен пристап. Насочената анализа се фокусира на мерење на изобилството на дефиниран сет на метаболити, како што се: Б. мерењата на лактат, кои ги опишуваме подолу. Спротивно на тоа, ненамерната анализа користи непристрасен пристап за да идентификува каква било метаболичка функција што значително се менува помеѓу двата сета примероци.
      Забелешка: Нашата лабораторија примарно ги користи бесплатните програми MetAlign 17 и MetaboAnalyst 18, 19 за анализа на податоци. Бидејќи адекватен опис на контролата на квалитетот, нормализацијата и чекорите за обработка на податоците се надвор од опсегот на овој ракопис, ние го упатуваме корисникот до подетални протоколи посветени на обработката на податоците 20, 21, 22. Покрај тоа, графиконот за опишување на чекорите за оваа анализа може да се најде на друго место 8.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    Мутантите на лактат дехидрогеназа (dLDH) кои немаат dLDH активност 4 и генетски соодветни контроли беа собрани како ларви од средината на L2 и обработени во согласност со протоколот опишан погоре. Во споредба со контролите, ларвите на мутантите покажуваат значителни промени во лактат, пируват и Л-2-хидроксиглутарат-4. Спектрите се стекнати на системот Agilent GC6890-5973i MS. Пример за генерирање спектри на GC-MS со нашиот протокол е прикажан на слика 1прикажано. Постојат многу видливи карактеристики и забележителен врв за трехалоза, кој е обично најголемиот врв во примерокот на ларвата и обично е презаситен (Слика 1АБ.) Индивидуалниот спектар на примерокот од негативна контрола е прикажан на слика 1прикажано. Иако сè уште има некои видливи врвови во примерокот од негативна контрола, интензитетот и бројот на врвови се намалуваат во споредба со експерименталните примероци прикажани во Сл. 1А, Б.. Овие врвови во суштина произлегуваат од крварење во колона, внатрешен стандард (килибарна киселина-d4 киселина), СЛАВИ и загадувачки масни киселини. Неуспешната подготовка на примерок генерира спектар сличен на оној на Слика 1прикажано.

    Спектрите беа претходно обработени со MetAlign 17 и податоците се нормализираа со внатрешниот стандард и масата на пелети. Податоците потоа беа доставени до MetaboAnalyst 18, 19 за статистичка анализа. Принципната компонента (Анализа, ПЦА) јасно покажува дека двете групи се одделуваат едни од други, не постојат издвојувања во ниту една група (Слика 2А) Понатамошната анализа покажува значителни промени во метаболитот, познати од загубата на dLDH (слика 2б) 4 да бидат погодени.

    подготовка

    илустрација 1 : Претставнички спектар на GC-MS од Дрософила Екстракт од ларви. (ОД) Типични спектри на екстракти од ларва од средината на L2 од див тип (WT) и dLDH мутанти (KO). (C) репрезентативен спектар на GC-MS генериран од негативна контрола (НК). Повеќето врвови во овој опсег се од внатрешни, славни и масни. (Д-Ф) Во споредба со WT примероците, примероците KO изложија зголемено ниво на (Г) Пируват и лактат (Д) и ()) 2-хидроксиглутарат (2-HG) намален. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

    гасна

    Слика 2 : Статистичката анализа ги покажува различните метаболички профили помеѓу дивиот тип (WT) и dLDH Ларви за нокаут (КО). (А) Заговор за PCA. (Б) -Метаболити кои имаат мутирани варијации во dLDH. Сите точки на податоци се извлекуваат во однос на средната вредност на контролниот елемент WT, која е поставена на која било вредност од 100. Пред анализата, податоците нормализирани за внатрешната килибарна киселина 4 беше стандардна и маса на ларвите на пелети. Податоците како средна ± една стандардна девијација. p Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Метаболомикс нуди единствена можност за мерење на метаболичките реакции за составување на средниот метаболизам. Сепак, чувствителноста на оваа технологија ги прави податоците ранливи на генетска позадина, знаци на развој и широк спектар на еколошки притисок, вклучувајќи температура, влажност, густина на население и достапност на хранливи материи. Оттука, висок квалитет и анализа на метаболомиката што може да се репродуцира бара примероците да се собираат под многу контролирани услови. Додека некои од објавите на оваа точка нагласуваат 3, 8, 23, тука ние нудиме чекор-по-чекор метод за собирање ларви дизајниран да обезбеди репродуктивност.

    Најчеста причина за варијабилност во анализата на метаболомиката произлегува од неуспехот на доењето или запирањето на метаболичките реакции по зафаќањето на примерокот. Во овој поглед, метаболизмот запира кога се замрзнува во течен азот и метаболичките ензими се уништуваат кога примерокот се хомогенизира на -20 ° C метанол. Под претпоставка дека корисникот посветува особено внимание на одржување на примерок замрзнат пред екстракција на метанол, нашиот протокол има за цел да обезбеди гарантирање дека метаболомичките податоци генерирани со оваа постапка претставуваат точна слика на метаболизмот на ларвата. Доколку корисникот доживее неприфатлива варијабилност на податоците, корисникот треба да го преиспита протоколот за собирање и екстракција на метаболит, посветувајќи особено внимание на обезбедувањето (1) метаболизмот брзо да се изгасне (чекори 2.9-4.2) и (2) примерокот да стане ефикасен хомогенизиран во 90% метанол (чекор 4.4). Во врска со ова, многу фабрики за монистра не даваат доволно енергија за хомогенизација на примероците во одреденото време и му препорачуваме на корисникот да користи инструмент што бил користен во претходните студии 8.

    И на крај, методите наведени овде се моќна алатка за метаболизмот на Дрософила. Овој протокол, сепак, не е специфичен за Дрософила и може да се користи за студии за метаболичко спроведување кај кој било мал без'рбетник со неколку измени. Без оглед на видот, овој едноставен метод може да се искористи за релативно квантифицирање на скоро сите аминокиселини, меѓупроизводи во гликолизата и циклусот TCA, како и на низа други мали поларни молекули. Во врска со неспоредливите генетски алатки достапни на заедницата Дрософила, овој тип на метаболомска анализа ја става мувата во првите редови на метаболичките истражувања за блиска иднина.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.