Напреден модел на глувци за безалкохолен стеатохепатит во врска со дијабетес тип 2
Резиме
Опишан е едноставен и сигурен модел на мечување предизвикан од диета за стеатохепатитис без алкохол (NASH), кој се постигнува преку не-СПФ-куќиште на животните и администрација на специфична диета со многу маснотии. Ние ја опишуваме идентификацијата на подмножествата на клетките на црниот дроб и маснотиите за да ги рекапитулираме имунитетните услови на човекот изложувајќи ги глувците на микробите во животната средина.
Апстракт
Дебелината е поврзана со хронично, слабо воспаление и отпорност на инсулин, што придонесува за зголемена преваленца на хронични метаболички заболувања, како дијабетес тип 2 и стеатохепатитис без алкохол (NASH). Најновите истражувања покажаа дека антиинфламаторните имунолошки клетки се инфилтрираат во дебели хипертрофични масни ткива и црн дроб. Со оглед на појавата на улогата на имуните клетки во метаболичката хомеостаза, има итна потреба да се измери и карактеризира нивната промена во развојот на дијабетес тип 2 и NASH. Сепак, животинските модели кои предизвикуваат патофизиолошки карактеристики типични за човечкиот NASH се ретки.
Во оваа статија ние обезбедуваме детален протокол за идентификување на подмножества на имунолошки клетки изолирани од црн дроб и масно ткиво во сигурен модел на глушец на NASH добиен со поставување на масни диетални масти (HFD) под неспецифични без патогени (SPF) нема услови за заклучување најмалку седум недели. Покажуваме ракување со глувци во несолени услови, варење на ткивото и идентификација на макрофагите, природните клетки убијци (НК), дендритичните клетки, подмножествата на Б и Т-клетките со цитометрија на проток. Дадени се репрезентативни протоци на цитометрија од глувци SPF-HFD и глувци кои не се SPF. Со цел да се добијат веродостојни и толкувани податоци, употребата на антитела, прецизни и прецизни методи за варење на ткивата и вистинскиот вид во експериментите со проточна цитометрија се клучни елементи.
Интервенцијата за враќање на физиолошката изложеност на антиген кај глувци со ставање во несловенски услови и неспецифично изложување на микробни антигени може да биде релевантна алатка за проучување на врската помеѓу имунолошките промени предизвикани од диетата. Дебелина и сродни долгорочни компликации.
Вовед
Дебелината е мултифакториелна болест и главен фактор на ризик за развој на срцеви заболувања, мозочен удар, стеатохепатитис без алкохол (NASH), дијабетес тип 2 (T2D) и некои видови на рак. Преваленцата на дебелина рапидно се зголемува низ целиот свет. Денес, 2,1 милијарди луѓе - скоро 30% од светската популација - се дебели или со прекумерна тежина 1. Отпорноста на инсулин поврзана со дебелина може да доведе до Т2Д кога исцрпените бета клетки на панкреасот не успеат да ја компензираат зголемената потреба за инсулин за одржување на хомеостазата на глукозата 2.
Масното ткиво е составено од различни типови на клетки, вклучувајќи ги и адипоцитите, ендотелните клетки, фибробластите и имуните клетки. За време на прогресијата на дебелината, промените во бројот и активноста на имуните клетки може да доведат до инфериорно воспаление на хипертрофично масно ткиво 3, 4. Поточно, беше откриено дека прекумерниот внес на енергија, придружен со хронично покачено ниво на шеќер во крвта, триглицериди и слободни масни киселини, доведува до хипоксија на маснотии, стрес на ендоплазматски мрежи, нарушена функција на митохондрија и зголемена секреција на цитокин, што доведува до активирање на антиинфламаторни масни клетки 5,6. Досегашните истражувања најмногу се фокусираа на вроден имунитет, но неодамна се појавија адаптивни имунолошки клетки (Т и Б клетки) како важни регулатори на хомеостазата на глукозата. Тие имаат воспалителни функции (вклучително ЦД8 + Т клетки, Т1 и Б клетки) или, пред сè, регулаторни функции (вклучително регулаторни Т (Трег) клетки, Т2 клетки) и можат и да ја влошат и заштита на инсулинската резистенција од 7,8 ., 9 септември
За да се проучат различните подмножества на имуните клетки во масното ткиво и црниот дроб во развојот на инсулинска резистенција и NASH во напредниот модел на глувче што репродуцира човечки имунолошки услови, глувците биле ставени во единечни кафези во полустерилни услови без никаква бариера. Глувците кои биле сместени во услови на изложеност на антигени, развиле патологија на црниот дроб сличен на NASH по само 15 недели диета богата со маснотии (HFD). Во споредба со возрасните соодветни СПФ глувци, тие развиле макровезикуларна стеатоза, инфилтрација на црниот дроб и активирање на имуните клетки.
Овој ракопис ја опишува робусната цитометриска анализа на проток за да ги дефинира и брои подмножествата на имуните клетки од масното ткиво и црниот дроб на глувчето во модел на NASH. Анализата на проточна цитометрија овозможува одредување на неколку параметри на одделни клетки во исто време за разлика од пристапите на RT-PCR или имунохистохемијата.
Сумирајќи, нашата студија обезбедува глувчешки модел на краткорочна HFD за да го проучи развојот на инсулинска резистенција и NASH и основните механизми кои исто така покажуваат верност на човечката состојба.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Протокол
Оваа студија е спроведена во согласност со Водичот на Националните здравствени институти за грижа и употреба на лабораториски животни и Законот за благосостојба на животните под надзор на нашиот институционален комитет за благосостојба на животните. Протоколите за животни беа спроведени во согласност со институционалните етички упатства на „Харите Берлин“ и одобрени од Државниот завод за здравствени и социјални работи и одговараат на АРИВЕ упатствата.
1. animalивотински модел предизвикан од диета на стеатохепатитис
2. Подготовка на реагенси и раствори
3-та генерација на суспензии на единечни клетки
5. Надомест на цитометрија на проток, набавка и порта
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
Репрезентативни резултати од екстрацелуларното боење на Т-клетките во глувскиот црн дроб на глувците изложени на HFD се прикажани на слика 3 А откриени во споредба со HFD SPF глувците. Навистина, поголем процент на ефикасни складишта ЦД4 + и ЦД8 + Т-клетки може да се открие кај глувци изложени на ХФД, додека интрахепатичните наивни ЦД4 + и ЦД8 + Т-клетки биле значително помали при изложеност во споредба со СПФ-глувците. Недела 7 (слика 3 А).
За да се потврдат овие резултати, хепаталната инфламаторна реакција поврзана со изложеност на антиген е испитана со боење на делови од црн дроб од глувци кои биле хранети 15 недели 13. Тешка стеатоза, вклучително и зголемување на големите липидни капки што доведоа до макровезичка стеатоза, воспаление на лобелија, хепатоцелуларно балонирање и нарушена лобулација, беше откриена кај глувци изложени на HFD, додека само неколку глувци од СПФ покажаа лесна акумулација на маснотии во црниот дроб (Слика 3Б). Како на слика3Ц извештаи, процентот на НК клетки во перигонадното масно ткиво на глувците изложени на HFD беше поголем, додека глувците HFD-SPF покажаа поголем процент на дендритички клетки. Не се пронајдени значителни разлики кај макрофагите и моноцитите. Генерално, овие резултати потврдуваат посериозна стеатоза на црниот дроб кај глувците изложени на HFD и помали разлики во масното ткиво помеѓу глувците изложени на HFD и SPF.
Табела 1 ги покажува антителата користени во Табела 1. Антителата што се користат при анализа на проточна цитометрија за екстраекуларно боење на Б-клетки, макрофаги, НК-клетки, дендритични клетки и гранулоцити се во Табела 2прикажано.
Слика 1 : Шематски приказ на стратегијата на портата што се користи при анализа на проточна цитометрија на дебелината (Табела 1). Прво клетките се затворени на синглови. Потоа нечистотијата се елиминира со користење на областа за расејување напред (FSC-A) и страничната површина на расејување (SSC-A) и избирање на вистинската големина. Клетките се карактеризираат и со изразување на ЦД45. Одржливите клетки се избираат со маркер на живи/мртви клетки, амино-реактивна боја која не е наменета за живи клетки, туку е наменета за клетки со компромитирана мембрана. Т-клетките беа поделени во цитотоксични Т-клетки (ЦД8 +) и Т-помошни клетки (ЦД4 +) и поделени на наивни (ЦД44 + ЦД62Л-), централно складирање (ЦД44 + ЦД62Л +), складирање на ефектори (ЦД44 + ЦД62Л -) и ефекторни (ЦД44 - ЦД62Л +) Т-клетки. Конечно, ЦД44 + клетките се затворени на KLRG1, CD127 и PD-1. Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа бројка.
слика 2 : Шематски приказ на стратегијата на портата што се користи при анализа на проточна цитометрија на масните клетки (Панел 2). Портата на дендритичните клетки се засноваше на изразување на CD11b и CD11c. Беа дефинирани следниве други популации: Б-клетки, НК-клетки, макрофаги, моноцити и гранулоцити. Податоците беа анализирани со соодветен софтвер по стекнувањето. Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа бројка.
слика 3 Слика: Цитометриска анализа на проток на проток на Т-клетки изолирани од глувско перигонадално масно ткиво и црн дроб. (А.) ЦД4 + и ЦД8 + Т-клетки од мирен црн дроб од 7 недели HFD глувци чувани под СПФ и изложените услови беа анализирани со проточна цитометрија. Б.) репрезентативно боење на 15 недели HFD SPF и изложени глувци. Инфилтрацијата на имуните клетки и диеталните влакна хепатоцити (врвови на стрели) го илустрираат NASH. Ц.) Пропорција на дебели вродени имунолошки клетки како процент на леукоцити кај HFD глувците што се чуваат под SPF или се изложени на услови 7 недели. n = 6-10 глувци по група. Значењето е утврдено со помош на двонасочни повеќекратни мерења на ANOVA. Податоците се претставени како средни ± СЕМ. * * P & lt; 0,01, * * * P 13 сменети. Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа бројка.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Дискусија
Стеатохепатитисот има силна поврзаност со метаболички нарушувања како што се дебелина, инсулинска резистенција и дислипидемија 15. Неколку студии сугерираат дека воспалението на масното ткиво може да предизвика патогенеза на дијабетес тип 2, вклучително и изменет број на клетки и во вродениот и во адаптивниот имунолошки систем 4, 5, 16, 17. Покрај тоа, откриено е дека дебелината го модулира активирањето на имунолошките патишта, што може да доведе до компликации на црниот дроб 18. Интересот за карактеризирање на фенотипите на имуните клетки кај дебелината и воспалението на црниот дроб расте, бидејќи секоја под-популација на имуните клетки различно придонесува за развој на инсулинска резистенција и стеатохепатитис.
Овој метод дава детални информации за тоа како да се изолираат и квантифицираат релативните количини на имунолошки клетки од перигонадалното масно ткиво и црниот дроб. Покрај тоа, методите покажуваат како глувците кои се хранат со HFD може да се чуваат во услови на не-сок за да се предизвика стеатохепатитис. Протоколот може да се користи за проучување на функциите на имуните клетки и за проучување на врските на специфични имунолошки клетки помеѓу различни ткива во микробиолошки нормализирана средина.
Во нашата сегашна студија, HRFD хранејќи не-sepF глувци резултираше со развој на инсулинска резистенција и стеатохепатитис, додека HFD SPF глувците развија инсулинска резистенција, лесна стеатоза на црниот дроб, но немаа стеатохепатитис како што е утврдено со имунохистохемија. Покрај тоа, подгрупите на мувла и масти во црниот дроб значително се разликуваа помеѓу глувците изложени на ХФД и СПФ, што го потврдува нашето разбирање за важноста на различните услови за живот. Како заклучок, можевме да покажеме дека изложеноста на микроби на заедница може драматично да влијае на имунолошките својства на глувците C57Bl/6. Претходната работа покажа дека различноста и функцијата на цревниот микробиом е под влијание на дебелината поврзана со исхраната 19, 20 и дека функцијата на интестиналната бариера и интестиналната пропустливост зависат од условите за живот 21. Во претстојната публикација, сакаме да ја разгледаме врската помеѓу колонизацијата на цревата и воспалението на маснотиите и црниот дроб.
Постојат неколку точки што треба да се земат предвид при планирањето на предложените методи. Прво, сите анализи на проточна цитометрија бараат едноклеточни суспензии, а врз издржливоста на клетките може да влијае и степенот на механичка дисоцијација на ткивото и времетраењето на варењето на ткивата. За да се избегне уништување на ебегитопот на антителата и да се зголеми приносот на функционално одржливи, раздвоени клетки, видот на ткивото, возраста на животното, генетските промени, концентрациите на ензимите, температурата и времето на инкубација треба да се земат предвид.
Второ, нашиот протокол беше оптимизиран за да се измерат различни фенотипови на влијанијални клетки од дебели глувци кои се хранат со ХФД со воспаление на масното ткиво и стеатохепатитис. Бидејќи бројот на имунолошки клетки, бројот на имунолошки клетки, а со тоа и квалитетот на варењето на ткивата, можат да бидат под влијание на воспалителните процеси, употребениот протокол и колагеназата треба да бидат оптимизирани за други ткива освен црниот дроб или масното ткиво во одредени експерименти. Што се однесува до методите на дисекција, времето на инкубација или колагеназата што се користи за варење на ткивото. Трето, за протоколот е важно да се вклучуваат различни експериментални групи на дневна основа со цел да се отстранат ефектите од дневната варијација на анализата на цитометријата на проток (температура, време на инкубација, итн.).
Конечно, ние обезбедуваме детален протокол за фенотипно карактеризирање на глувчеста адипоза и имуните клетки на црниот дроб со користење на проточна цитометрија во животински модел на НАС и отпорност на инсулин. Со оглед на сложената функција и регулирање на вродени и адаптивни клетки поврзани со дебелина и метаболичка дисрегулација, нашите предложени методи треба да помогнат да се продлабочи разбирањето на имунолошките механизми за балансирање на метаболичката хомеостаза. И така, помогне да се развие човечка терапевтика што може да ги врати антиинфламаторните имунолошки одговори. Генерално, доставениот животински модел служи како брз и робустен модел за проценка на метаболичките компликации поврзани со дебелината и може да се примени и на други модели на болести.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.